Il tendine è una struttura di tipo connettivale costituita da abbondante matrice extracellulare (ECM) e da una componente cellulare con prevalenza dei tenociti sui tenoblasti. La matrice si compone di fibre collagene (prevalentemente di tipo I) e elastiche, e di una sostanza amorfa con proteoglicani e glicosaminoglicani. La componente cellulare è minoritaria e con capacità rigenerative tradizionalmente ritenute limitate. Queste caratteristiche hanno reso spesso inefficaci diverse terapie conservative finalizzate alla cura di tendinopatie croniche. Tuttavia da qualche anno si sono imposti approcci strategicamente innovativi il cui beneficio clinico sembra potersi correlare con una induzione della fase riparativa. In questo studio ci proponiamo per la prima volta di investigare in vitro i meccanismi di azione di alcune di queste terapie, mediante l'esposizione di colture primarie di tenociti a campi magnetici ad alta frequenza (Electromagnetic Transduction Therapy: EMTT). Sulla scorta dell'esperienza fatta dal nostro gruppo di ricerca in precedenti lavori con modelli cellulari esposti in vitro all'azione delle onde d'urto (Extracorporeal Shock Wave Therapy: ESWT), contiamo di ripercorrere le stesse tappe nell'indagare le conseguenze dei trattamenti con EMTT in vitro.
In particolare verranno confrontati gli effetti di EMTT ed ESWT sulla capacità proliferativa, migratoria e secretiva dei tenociti: tutte proprietà imprescindibili per suggerire l'induzione di possibili potenzialità rigenerative a seguito del danno tendineo. Inoltre sarà valutata -mediante RT-PCR- l'espressione di caratteristici marcatori tenocitari (quali Collagene 1-3, Tenomodulina, Tenascina-C e Sclerassi).
In questa ricerca, il confronto fra colture provenienti da tendine sano con quelle espiantate da tendine lesionato potrà aggiungere ulteriori contributi alla comprensione dei meccanismi biologici evocati dall'esposizione a EMTT ed ESWT.
L'innovatività di questo progetto consiste nel fatto che sarebbe la prima ricerca -a nostra conoscenza- che si proponga di paragonare in vitro gli effetti biologici dell'esposizione di colture primarie provenienti da biopsie di tendine umano a ESWT vs EMTT.
Quest'ultima strategia terapeutica si basa su meccanismi di magneto-trasduzione ed è importante verificare se gli effetti prodotti sulle cellule siano effettivamente simili a quelli della meccano-trasduzione indotta dalle onde d'urto. Rispetto ad altre forme di magnetoterapia (quali la PEMF) che sfruttano i campi elettromagnetici pulsati, la terapia extracorporea a trasmissione elettromagnetica si caratterizza per la sua elevata frequenza di oscillazione, che gli consente una maggiore profondità di penetrazione all'interno del tessuto, senza peraltro causare significativi effetti collaterali. Ovviamente anche questa ricerca contiene delle intrinseche limitazioni interpretative, che nascono dalla difficoltà di estrapolare dati ottenuti in vitro, per la valutazione di situazioni cliniche complesse osservate in vivo. Infatti è presumibile affermare che in vivo si possa creare uno speciale microambiente ove interagirebbero più componenti, altrimenti assai difficilmente riproducibili in un modello cellulare. Pensiamo ad esempio a reazioni infiammatorie e a processi di neovascolarizzazione in grado di convogliare nel tessuto danneggiato cellule e molecole di vario tipo, quali citochine, fattori di crescita, glicosaminoglicani e metalloproteasi. Questo complesso network di molecole può essere reclutato nel tendine lesionato soprattutto grazie all'induzione di neoangiogenesi, considerato che i tendini sono fisiologicamente sprovvisti di un adeguato apporto ematico (Longo UC. et al., Sports Med Arthrosc Rev. 2009). Tuttavia il significato funzionale dell'aumento dell'irrorazione del tendine innescato dal danno non è mai stato del tutto chiarito, né sembra correlarsi in modo direttamente proporzionale al peggioramento della sintomatologia dolorosa.
Sarebbe quindi auspicabile allestire colture primarie di tenociti umani sui quali valutare -in seguito all'esposizione a campi elettromagnetici ad alta frequenza oppure ad onde d'urto- non solo aspetti che si correlino alla riparazione tessutali (come proliferazione, migrazione e secrezione di nuovo collagene), ma anche alla neonagiogenesi (quali ad esempio la produzione di VEGF). Volendo schematizzare le diverse tappe del processo, potremmo quindi riassumerle come segue:
a) allestimento di almeno 2 colture primarie di tenociti provenienti da tendine sano (frammenti di semitendinoso utilizzato per l'intervento di ricostruzione del legamento crociato anteriore).
b) allestimento di almeno 2 colture primarie di tenociti provenienti da tendine lesionato (frammenti di tendine d'Achille sottoposto a chirurgia ricostruttiva dopo rottura completa).
c) caratterizzazione morfologica e molecolare dei tenociti eseguita mediante l'espressione di caratteristici marcatori tenocitari (quali Sclerassi, Tenomodulina, Tenascina-C e i Collageni di tipo I e III).
d) studio delle modalità di esposizione e della vitalità delle cellule dopo EMTT, considerando che le dosi utilizzate rientrino nei range di frequenza fra 5 e 10 impulsi/sec e una oscillazione compresa tra i 100 e i 300 kHz. Questi valori sono infatti quelli che hanno mostrato una efficacia terapeutica nella pratica clinica per la cura delle tendinopatie croniche.
Viceversa l'esposizione ad onde d'urto verrà eseguita come descritto in precedenti lavori (Vetrano M. et al., KSSTA 2011).
e) analisi della proliferazione cellulare (mediante conta cellulare e/o espressione del marcatore nucleare Ki67 che identifica le cellule ciclanti) in seguito all'esposizione con EMTT o ESWT
f) analisi della migrazione cellulare (mediante Scratch Test) in seguito all'esposizione con EMTT o ESWT
g) valutazione delle potenzialità rigenerative indotte dai nostri trattamenti mediante espressione con RT-PCR dei sopracitati marcatori tenocitari
h) studio delle capacità secretive delle cellule con particolare riferimento alla produzione di collagene I (quello maggioritario nella matrice, che conferisce resistenza e stabilità al tendine definitivo) rispetto al collagene III (che caratterizza soprattutto la fase rigenerativa del tendine)
i) raccolta dei supernatanti di coltura per la valutazione quantitativa di citochine e fattori di crescita (IL-6, TNF-alpha, IL-10 e VEGF) potenzialmente implicati nei fenomeni infiammatori e rigenerativi del tendine.
In particolare sarebbe interessante verificare se la magneto-trasduzione suscita effetti più significativi (o comunque differenti) rispetto alla meccano-trasduzione, sopratutto nelle cellule provenienti da tendine lesionato. Per ovvi motivi infatti, quest'ultima condizione potrebbe rappresentare il modello cellulare che "mima" più fedelmente la situazione patologica che riscontriamo in vivo durante le tendinopatie croniche.