Le potenzialità rigenerative dei tendini umani sono fisiologicamente limitate da una ridotta vascolarizzazione e dalla loro scarsa componente cellulare (tenociti e tenoblasti). Tali cellule sono però responsabili del corretto mantenimento di una abbondante matrice extracellulare (ECM), costituita da fibre collagene (soprattutto di tipo I) e elastiche e da una sostanza amorfa con proteoglicani e glicosaminoglicani. Lo stress meccanico agisce su queste cellule (mediante meccanotrasduzione) innescando un network di segnali (fattori di crescita, citochine, ecc.) capaci di indurne proliferazione, migrazione, sopravvivenza e risposte metaboliche di vario tipo. Contemporaneamente uno stress eccessivo su tale tessuto connettivale può causarne quadri degenerativi difficili da gestire terapeuticamente (tendinopatie croniche). Da qualche anno sono allo studio promettenti terapie non invasive, quali l'applicazione locale di campi magnetici ad alta frequenza (Electromagnetic Transduction Therapy (EMTT), il cui beneficio clinico sembra ascrivibile all'induzione di rigenerazione tendinea.
Ci proponiamo quindi di valutare gli effetti dell'esposizione di colture primarie di tenociti umani a EMTT.
Sulla scorta dell'esperienza fatta dal nostro gruppo di ricerca in precedenti lavori eseguiti su modelli cellulari trattati con onde d'urto (ESWT), contiamo di ripercorrere le stesse tappe, utilizzando le colture primarie precedentemente allestite nell'indagare le conseguenze dei trattamenti con EMTT.
In particolare verranno studiate morfologia, capacità proliferativa, migratoria e secretiva dei tenociti prima e dopo EMTT: elementi imprescindibili per suggerire l'induzione di possibili meccanismi rigenerativi. L'espressione molecolare in RT-PCR di caratteristici marcatori del processo di differenziamento tenocitario si baserà sull'analisi qualitativa e quantitativa di molecole quali Collagene 1-3, Tenomodulina, Tenascina-C, Sclerassi e alfa-Actina della muscolatura liscia (alpha-SMA).
Il progetto proposto è sicuramente innovativo, poiché rappresenterebbe il primo tentativo -a nostra conoscenza- di valutare contemporaneamente sia le possibili modificazioni morfologiche (attraverso osservazioni al microscopio ottico ed elettronico a trasmissione), che quelle funzionali (mediante lo studio degli effetti motogeni e mitogeni) e molecolari (mediante la valutazione dell'espressione di diversi geni) indotte dall'esposizione delle nostre colture primarie ad EMTT. Questa innovativa tecnica terapeutica si fonda su meccanismi di magneto-trasduzione ma, rispetto ad altre forme di magnetoterapia (quali la PEMF) che sfruttano i campi elettromagnetici pulsati, si caratterizza per la sua elevata frequenza di oscillazione, che consente una maggiore profondità di penetrazione all'interno del tessuto, senza peraltro causarne significativi effetti collaterali. Rispetto ai tradizionali campi magnetici pulsati, questa nuova e promettente tecnologia si basa quindi su intensità (tra 80 e 150 mT) e frequenze (tra 100 e 300 kHz) molto più elevate, che possono essere raggiunte grazie all'uso di generatori ad alta velocità, capaci di creare voltaggi fino a 30 kV che vengono rilasciati in pochi nanosecondi. Questa brevissima durata di ciascun impulso garantisce una reazione elettrofisiologica completa, senza alcun incremento termico a livello del tessuto (Krath A et al, J Orthop 2017). Inoltre, poiché sia le vie di trasduzione del segnale che le vie metaboliche rispondono agli impulsi elettromagnetici solo se questi superano la soglia di 10 mT, questa nuova tecnologia si propone di agire in maniera più efficace sulle cellule, sugli spazi intercellulari e sullo spostamento di ioni dovuto a processi infiammatori. Per esempio, quando la cellula è esposta a EMTT cambia il potenziale elettrico della sua membrana, consentendo agli ioni Ca2+ di migrare all'interno della stessa. Inoltre l'EMTT può agire sull'attivazione ligando-indipendente dei recettori tirosino-chinasici e sull'aumentata espressione di recettori per l'adenosina in vari tipi di cellule, quali neutrofili, condrociti e sinoviociti. Ipotizziamo che questo trattamento possa efficacemente determinare una significativa riduzione di citochine pro-infiammatorie (quali IL-6 e IL-8). A questo proposito ricordiamo che nella tendinopatia cronica si osserva un aumento di mediatori dell'infiammazione, come le citochine infiammatorie, comprese quelle di origine macrofagica (IL-1ß, IL-6, TNF-alpha che sono generalmente aumentate). L'ultimo punto riguarda l'aumento, ripetutamente documentato nelle tendinopatie, del Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) e delle cicloossigenasi tipo 2 (COX2). A questo proposito l'energia elettromagnetica potrebbe agire sui tenociti sia limitando l'effetto catabolico delle molecole proinfiammatorie che aumentando la proliferazione cellulare e la conseguente sintesi di componenti dell'ECM. Dai primi dati emersi risulterebbe che cellule mesenchimali sottoposte a trattamento con campi elettromagnetici ad alta intensità mostrano un'aumentata espressione di collagene tipo I, fosfatasi alcalina, osteocalcina e BMP-2, dimostrando un'attività cellulare che ben si correlerebbe con l'induzione di fenomeni rigenerativi (Klüter T et al, Electromagn Biol Med 2018). Reazioni infiammatorie e processi di neoangiogenesi potrebbero contribuire a richiamare nel tessuto danneggiato cellule e molecole di vario tipo (Gedersmeyer L et al, J Foot Ankle Surg. 2017) e ciò risulterebbe ancor più importante in tessuti fisiologicamente sprovvisti di un adeguato apporto ematico, quali sono appunto i tendini (Gedersmeyer L et al, J Foot Ankle Surg. 2017; Longo UC. et al, Sports Med Arthrosc Rev. 2009). Tuttavia, va sottolineato che il significato funzionale dell'aumento di vascolarizzazione nel tendine lesionato non è mai stato del tutto spiegato, né questo sembra -fino ad oggi- potersi correlare direttamente al peggioramento della sintomatologia dolorosa.
E' quindi nostra intenzione valutare dopo EMTT i seguenti aspetti:
1. Modificazioni morfologiche delle cellule in coltura, con particolare riferimento alla loro forma (con microscopia ottica) e valutazione ultrastrutturale di componenti citoplasmatici come organelli, reticolo, ecc. (con microscopia elettronica a trasmissione: TEM)
2. Processo di differenziamento cellulare, mediante l'espressione molecolare in RT-PCR di caratteristici marcatori (quali Sclerassi, Tenomodulina, Tenascina-C, alpha-SMA e Collageni I e III).
3. Proliferazione cellulare (mediante espressione del marcatore Ki67 che identifica le cellule in duplicazione)
4. Analisi della migrazione cellulare (mediante Scratch Test)
5. Studio delle capacità secretive delle cellule in coltura (Collagene I e III, citochine proinfiammatorie, VEGF, ecc.)
Ovviamente questa ricerca contiene delle intrinseche limitazioni interpretative, provenienti dalla difficoltà di estrapolare dati ottenuti in vitro per la valutazione di situazioni cliniche osservate in vivo.