Il termine sequenziamento di nuova generazione (NGS) comprende metodiche e tecniche che permettono il sequenziamento massivo parallelo di centinaia di migliaia di frammenti di DNA o RNA. La messa a punto e innovazione della tecnologia NGS ha rivoluzionato radicalmente la genomica clinica, aprendo nuove prospettive di studio e opportunità di applicazione della conoscenza sulle varianti geniche e sulle loro associazioni funzionali in patologie ereditarie e acquisite. Infatti, lo studio dettagliato delle regioni codificanti e non codificanti del genoma del singolo individuo, come richiesto per una efficace medicina personalizzata, rappresenta la sfida futura della "genomica clinica integrata funzionale" per lo sviluppo di nuovi biomarcatori diagnostici e prognostici, utili anche per le scelte terapeutiche e per l'arruolamento dei pazienti negli studi clinici. La presente richiesta di finanziamento per l'acquisto di un sequenziatore NGS è proposta da un gruppo di Docenti della Facoltà di Medicina e Psicologia che intendono avvalersi di questa tecnologia, ciascuno nel proprio ambito di ricerca, allo scopo di stabilire a livello somatico o germinale una correlazione tra varianti identificate nei geni d'interesse e eziopatogenesi della patologia oggetto di studio. Si prevede di utilizzare la piattaforma NGS per: a) l'analisi di mutazioni germinali in pazienti con tumore della mammella/ovaio BRCA1/2 negativi; b) la caratterizzazione molecolare delle sindromi aritmiche ereditarie; c) l'identificazione di genotipi complessi nella cardiomiopatia ipertrofica (HCM); d) la caratterizzazione molecolare dei carcinomi della cervice uterina associati all'infezione da Papillomavirus (HPV); e) la caratterizzazione molecolare dell'adenocarcinoma del colon sinistro ad insorgenza precoce (50 anni); f) l'inquadramento diagnostico, la stratificazione prognostica e l'identificazione di bersagli terapeutici nelle malattie oncoematologiche.
L'aumento dei geni causativi correlati alle malattie umane è associato con l'implementazione della metodica NGS. Il sequenziamento Sanger, che è stato il gold standard nelle malattie mendeliane classiche [17], non sempre raggiunge l'obiettivo diagnostico in assenza di un fenotipo clinico certo [18]. Il sequenziamento NGS, che consente di analizzare simultaneamente a costi e tempi ridotti un elevato numero di geni, viene sempre più utilizzato nelle malattie clinicamente eterogenee come le cardiomiopatie e le aritmie [19] dove sono stati identificati diversi geni correlati ad un ampio spettro fenotipico [20]. Nell'ambito di questo progetto si inserisce pertanto il gruppo di ricerca di Cardiologia della Facoltà di Medicina e Psicologia, con il Centro di Diagnosi e Cura delle Cardiomiopatie e delle Malattie Aritmogene Ereditarie, con oltre 30 anni di esperienza nello studio della cardiomiopatia ipertrofica (HCM), forte di un database di oltre 1000 pazienti. In collaborazione con il gruppo della Genetica Medica della Facoltà, i pazienti con HCM saranno caratterizzati dal punto di vista clinico-molecolare. In campo oncologico l'introduzione della metodica NGS ha rivoluzionato la ricerca clinica e genetica. Il gruppo di Genetica Medica, in collaborazione con la Breast Unit e la Dermatologia dell'Ospedale Universitario Sant'Andrea di Roma, si occupa dal 2006 di test genetici per la ricerca di mutazioni germinali nei geni BRCA1/2 in pazienti con tumori della mammella/ovaio e collabora con ENIGMA (Evidence-based Network for Interpretation of Germline Mutant Alleles), un consorzio internazionale che si occupa della interpretazione e classificazione delle varianti dei geni BRCA1/2 [21]. Forte di questa esperienza e di una casistica caratterizzata sia da un punto di vista molecolare che clinico, si propone di analizzare mediante NGS, con un pannello multigenico, pazienti con tumore della mammella/ovaio negativi per mutazioni BRCA1/2. Lo scopo e' quello di identificare fenotipi BRCAness che possano giovarsi dal punto di vista clinico/terapeutico del risultato della ricerca e inoltre quello di identificare nuovi possibili target terapeutici [22]. La caratterizzazione genetico-molecolare dei tumori anche dal punto di vista somatico risulta fondamentale in termini di diagnosi, prognosi e terapia. Molte alterazioni geniche acquisite producono proteine con attività aberrante e rappresentano potenziali bersagli terapeutici modulabili mediante l'uso di specifici inibitori [23]. In questo contesto si inseriscono i progetti di ricerca proposti per lo studio del tumore della cervice uterina, del carcinoma del colon e dei tumori oncoematologici.
Ai fini della realizzazione di questi progetti, si rende necessario l'utilizzo di una tecnologia NGS in grado di offrire un sequenziamento rapido in multiplex per un'ampia gamma di applicazioni e che consenta corse su piccola scala più rapide e più convenienti in termini economici. Attualmente due diverse tecnologie NGS sono utilizzate nei laboratori clinici: la tecnologia IonTorrent e Illumina [24]. Entrambe hanno in comune il sequenziamento parallelo massivo di molecole di acido nucleico amplificato in modo clonale, ridotte in frammenti di 200-400 bp e separate spazialmente in una cella a flusso (flow cell). Si differenziano principalmente per due caratteristiche: la chimica utilizzata nel procedimento di preparazione delle librerie e il processo di sequenziamento. Da questi due parametri ne derivano altri: lunghezza delle reads, megabasi sequenziate, tempi di corsa, accuratezza dei dati grezzi, costo iniziale della tecnologia, costo per campione. La tecnologia IonTorrent sfrutta la PCR ad emulsione ed è basata sul rilevamento di variazioni di pH che si hanno quando una base viene incorporata nella molecola di DNA durante la sintesi con conseguente perdita di uno ione idrogeno. Un chip di silicio modificato rileva la modificazione del pH. La tecnologia Illumina si basa sul sequenziamento Solexa che usa terminatori fluorescenti reversibili e amplificazione clonale mediante "bridge-PCR" con rilevazione del segnale mediante una piccola "flow-cell". Nel 2018 Illumina unisce l'accuratezza e precisione della tecnologia Illumina con la possibilità di utilizzare la tecnologia AmpliSeq della Termo Fisher, offrendo un sequenziamento rapido in multiplex per un'ampia gamma di applicazioni nella pratica clinica. Il sistema MiniSeq Illumina consente, rispetto a sistemi di sequenziamento più grandi, corse su piccola scala con la praticità di un sistema da banco economico e di facile utilizzo.
Referenze:
17. Rhem et al. Genet Med 2013; 15: 733-47
18. William et al. Adv Anat Pathol 2013; 20: 238-44
19. Rehem. Nat Rev Genet 2013; 14: 295-300
20. Wilcox et al. Curr Opin Cardiol 2018; 33: 354-62
21. Eccles et al. Ann Oncol. 2015; 26: 2057-65.
22. Manchanda et al. J Med Genet 2018; 55: 538-45
23. Tan et al. Clinical Genetics 2018; 93: 533-44
24. Quail et al. BMC Genomics. BioMed Central. 2012;13: 341.