La presente proposta intende essere il logico proseguimento di progetti di ricerca già oggetto di finanziamento da quest'Ateneo e rivolti a indagare a livello proteomico la natura degli eventi molecolari che innescano una transizione neurotossica della microglia in modelli cellulari di malattie neurodegenerative. L'evidente obiettivo a lungo termine di questi studi è individuare target molecolari idonei a indirizzare strategie di contenimento della patologia degenerativa.
I risultati ottenuti fino ad oggi dal gruppo dei ricercatori proponenti hanno contribuito a rivelare come nella trasformazione che consegue l'attivazione prolungata da parte di peptidi Abeta amiloidi sia possibile determinare mediante l'approccio proteomico un ampio set di marcatori coinvolti in selettive vie di segnalazione. Queste vie sono in grado di guidare la microglia nella transizione verso un fenotipo infiammatorio, sia per modulazione funzionale a seguito di modificazione post-sintetica, sia per induzione trascrizionale, sia per diversa compartimentazione. Tra questi particolarmente rilevante per la ricerca di target farmacologici è il gruppo di biomarcatori recentemente individuato a livello del compartimento della membrana plasmatica.
Nell'impalcatura dell'indagine che si propone con questa richiesta di finanziamento sono comprese tre linee di ricerca che in modo parallelo ma intimamente complementare contribuiranno ad approfondire l'analisi degli eventi molecolari della trasformazione microgliale neurotossica. Come primo obiettivo s'intende analizzare per la prima volta il ruolo modulatorio della modificazione post-sintetica nota con il termine di poliADP-ribosilzione o "parilazione". Inoltre, si intende estendere la determinazione dei biomarcatori della neurotossicità esplorando il compartimento esosomiale. Infine si tenterà di verificare un possibile collegamento tra la risposta del compartimento microgliale e la nuova ipotesi sull'eziologia di natura infettiva dell'AD.
Precedenti studi proteomici sulla microglia hanno indicato alcune caratteristiche generali del fenotipo che si instaura nel SNC a seguito della stimolazione prolungata con il peptide beta amiloide. Tra queste di particolare rilievo è l'evidenza che la transizione verso l'attivazione cronica di queste cellule sentinella è favorito in misura rilevante da modificazioni post-sintetiche e in misura più contenuta da variazioni dell'espressione genica o della compartimentalizzazione.
In questa proposta, noi ipotizziamo che la poliADP-ribosilazione, una modifica post-sintetica operata dalla famiglia delle PARP, enzimi attivati dal danno ossidativo del DNA, possa essere responsabile non solo dell'attivazione di proteine specifiche per la riparazione del danno genotossico ma anche di fattori coinvolti nelle peculiarità morfologiche e funzionali che caratterizzano le cellule microgliali nella patologia di Alzheimer.
In sintesi è possibile riassumere tali caratteristiche come tre processi principali evidenziati dai precedenti studi proteomici svolti dal nostro gruppo: i) alterazione della proteostasi coinvolgente sia meccanismi di trascrizione che meccanismi di proteolisi cellulare dipendenti dal distretto lisosomiale o dal sistema ubiquitina proteasoma; ii) produzione cronica di citochine mediante alterazione del meccanismo di risoluzione del processo infiammatorio, e iii) modificazione del citoscheletro con intensificazione dell'attività di produzione di esosomi per la comunicazione con i distretti astrociatario e neuronale.
Se la nostra ipotesi si rivelerà corretta e questi processi risulteranno regolati parzialmente o in misura consistente tramite modificazione covalente mediante poliADP-ribosilazione di proteine coinvolte, questa conoscenza potrebbe immediatamente essere tradotta verso trial clinici in quanto sono già disponibili vari inibitori specifici dell'attività della PARP-1, il principale enzima attivato dal danno genomico. Si confermerà inoltre l'attività della PARP-1 su enzimi che esulano dallo stretto ambito nucleare, come suggerito da studi recenti che sembrano individuare l'attività di questo enzima anche a livello mitocondriale indicando un coinvolgimento di questa modifica post-sintetica anche nei processi metabolici e nell'economia generale dell'energia della cellula, a ulteriore conferma dell'interconnessione dei processi infiammatori con il metabolismo energetico delle cellule. La poliADP-ribosilazione potrebbe attivare anche le proteine coinvolte nell'aumento dell'attività di estrusione di vescicole lisosomiali che si osserva nella microglia attivata. Questa attività sarà oggetto di uno studio comparativo volto ad evidenziare le differenze qualitative e quantitative del contenuto delle vescicole esosomiali tra la microglia a riposo e quella attivata dal peptide amiloide. Questo per la prima volta permetterà di indagare il cambiamento di comunicazione che avviene tra i vari gruppi cellulari del SNC e gli eventuali segnali neurotossici in grado di confermare in maniera inequivocabile il ruolo delle cellule microgliali nel processo neurodegenerativo che si osserva nella malattia di Alzheimer.
I profili proteomici delle proteine poliADP-ribosilate e del contenuto esosomiale potranno chiarire l'eventuale ruolo di agenti infettivi nell'innescare/facilitare l'insorgenza o la progressione del morbo di Alzheimer come recentemente proposto in un articolo firmato da numerosi microbiologi. L'analisi della variazione dei marcatori identificati in presenza di proteine di C. albicans secrete o estratte dalla parete potrebbe dimostrare che anche gli agenti infettivi possono evocare il fenotipo cronico tossico o possono indirizzare, esacerbare o sensibilizzare le cellule microgliale all'azione del peptide beta amiloide.
Nel complesso la nostra proposta dovrebbe far avanzare la ricerca verso lo sviluppo di un modello conseguenziale che partendo dal danno ossidativo prodotto dall'accumulo del peptide amiloide e dall'attivazione dell'attività pro-infiammatoria della microglia, porta al danno del DNA nucleare ed all'innesco della PARP-1. Tale attivazione modifica proteine chiave che permettono alla microglia lo stabilirsi del fenotipo neurotossico che tramite la produzione di superossido e citochine e di mediatori trasportati dalle vescicole lisosomiali determinano la morte neuronale. L'eventuale coinvolgimento di agenti infettivi potrebbe chiarire meglio l'eziologia di questa malattia purtroppo ancora molto elusiva.