Le sinucleine (sin) sono una famiglia che comprende le tre proteine alfa- (a-), beta- (b-) e gamma- (g-) sin particolarmente espresse nel sistema nervoso che sono coinvolte in alcune patologie neurodegenerative e in forme tumorali. Scoperte inizialmente nell'encefalo della razza elettrica Torpedo californica, membri della famiglia delle sin sono stati sequenziati in specie rappresentative di tutte le classi di vertebrati e l'analisi comparativa delle sequenze amminoacidiche suggerisce che siano evolutivamente conservate. La ricerca si è concentrata soprattutto su modelli di mammifero dove particolarmente studiata è l'a-sin per il suo coinvolgimento in diverse patologie neurodegenerative complessivamente denominate sinucleinopatie. Tra queste vi è la malattia di Parkinson dove l'a-sin forma i corpi di Lewy, aggregati proteici che costituiscono i marker istologici di questa patologia e dove mutazioni di un solo amminoacido della proteina sono associate a forme familiari. Il premio Nobel Stanley Prusiner ha definito l'a-sin il nuovo prione umano per la sua capacità di cambiare conformazione passando da forme fisiologiche a forme patogene ricche in foglietti beta che tendono a creare fibrille e ad aggregare in precipitati insolubili. Le informazioni sulle sin nelle varie classi di vertebrati non mammiferi sono ancora scarse. Questo progetto vuole proseguire gli studi condotti dal nostro gruppo di ricerca negli ultimi anni che sono volti ad indagare le sin in specie modello di pesci (Cyprinus carpio e Danio rerio), anfibi (Xenopus laevis) e rettili (Anolis carolinensis). Verranno prodotte sin ricombinanti delle specie oggetto di studio per testare anticorpi commerciali in grado di discriminare le diverse isoforme. Tali anticorpi verranno utilizzati per studiare l'espressione e la localizzazione delle sin in queste specie. Inoltre le sin ricombinanti verranno utilizzate per analizzare la struttura secondaria mediante spettroscopia di dicroismo circolare.
Come descritto sopra, le sin sono proteine peculiari ed estremamente affascinanti da un punto di vista biologico ed evolutivo. Presenti solo nei vertebrati, le sin sono particolarmente espresse nel sistema nervoso, dove si ritiene assolvano a importanti funzioni essendo coinvolte in patologie neurodegenerative quali la malattia di Parkinson. La struttura delle sin può variare passando da una conformazione non strutturata, a conformazioni caratterizzate dalla presenza di alfa eliche o foglietti beta. Tali variazioni sono influenzate da parametri chimico fisici quali pH e temperatura, dalla presenza di mutazioni puntiformi della struttura primaria e possono essere guidate da meccanismi prion-like.
Data la peculiarità e l'importanza di queste proteine, ulteriori studi sono necessari per ottenere un quadro chiaro sul loro ruolo fisiologico e sul loro coinvolgimento nelle patologie neurodegenerative. Il livello di conservazione delle sin a livello evolutivo suggerisce che i ruoli fisiologici da esse assolti siano fondamentali per l'organismo e che specie di vertebrati non mammiferi possano costituire nuovi modelli in cui studiare queste proteine. Lo studio dell'evoluzione delle sin, delle loro caratteristiche nelle diverse classi di vertebrati diventa strumento utile per acquisire nuove informazioni che possono essere traslate anche all'uomo.
Poiché le funzioni delle sin sono strettamente correlate alla loro conformazione e poiché anche modifiche di un solo amminoacido possono alterare la tendenza della proteina ad acquisire struttura ad alfa elica o a foglietto beta, diventa interessante analizzare la struttura delle sin non solo nei mammiferi ma anche negli altri taxa di vertebrati. Nell'uomo sei mutazioni amminoacidiche dell'a-sin sono associate alla malattia di Parkinson: A30P, E46K, H50Q, G51D, A53T, and A53E. Gli amminoacidi in queste posizioni non sono sempre conservati a livello evolutivo. L'analisi delle sin nella lucertola Anolis carolinensis ha evidenziato che nella lucertola l'istidina (H) in posizione 50 è sostituita da una glutammina (Q) e l'alanina (A) in posizione 53 è sostituita da una treonina (T). Questi cambiamenti corrispondono esattamente alle mutazioni H50Q (34,63) e A53T (64) che nell'uomo sono associate alla malattia di Parkinson. In particolare la mutazione A53T altera la struttura dell'a-sin espandendo il dominio idrofobico (da 11 a 30 amminoacidi), destabilizzando il dominio ad alfa elica (65) e facilitando il ripiegamento della proteina in foglietto beta, condizione necessaria per la formazione di oligomeri (65-68). La presenza della treonina (T) nella posizione 53 è stata descritta nell'a-sin di vari pesci, uccelli e mammiferi incluse alcune scimmie (54,69). Sulla base di queste osservazioni si può ipotizzare che l'a-sin di A. carolinensis sia più propensa ad acquisire struttura ad alfa elica e a formare aggregati, condizione che nell'uomo è associata a patologie neurodegenerative.
Il conseguimento degli obiettivi proposti permetterà un importante avanzamento delle conoscenze sulle sin in vertebrati non mammiferi. In particolare la produzione di sin ricombinanti delle specie oggetto di studio permetterà di individuare anticorpi commerciali in grado di riconoscere e discriminare le loro sinucleine. Questo permetterà di indagare l'espressione di a-, b- e g- sin nel sistema nervoso e nei principali organi di individui adulti delle specie considerate mediante WB. Gli stessi anticorpi potranno essere utilizzati per localizzare in quali cellule siano espresse le sin mediante metodiche di immunoistochimica.
I risultati potranno essere comparati con quelli disponibili nei mammiferi per verificare se ci siano differenze nel pattern di espressione delle sin tra i vari taxa di vertebrati e sulla base di eventuali discrepanze si potranno ipotizzare possibili differenze evolutive nelle funzioni di queste proteine. Le proteine ricombinanti permetteranno anche di acquisire informazioni circa la struttura secondaria delle sin nelle specie oggetto di studio e di verificare se le differenze nella sequenza primaria determinano un incremento delle strutture a foglietto beta che aumentano la tendenza delle proteine a formare strutture fibrillari e precipitati. La variazione dei parametri chimico fisici della soluzione o l'aggiunta di metalli permetterà di individuare le sin più suscettibili ad un cambio conformazionale. Inoltre, l'analisi delle diverse isoforme sin per ognuna delle specie oggetto di studio permetterà di evidenziare possibili differenze nella stabilità e/o propensione all'aggregazione sia tra le diverse specie che nell'ambito della stessa specie, fornendo un quadro più completo della biologia di queste enigmatiche proteine.