Il progetto si basa su dati da noi ottenuti in collaborazione con il CAST (Prof. Renato Mariani Costantini) dell'Università G. d'Annunzio di Chieti, che suggeriscono che i paragangliomi, rari tumori del sistema nervoso autonomo, si sviluppino attraverso un programma di organogenesi iscritto nelle cellule staminali della cresta neurale embrionale sfruttato da un herpesvirus trasmissibile, strutturalmente affine al citomegalovirus umano (CMV).
Obiettivi: Miriamo alla caratterizzazione genetica, ultrastrutturale e funzionale di ceppi di virus derivati da tumori di pazienti, in modo da utilizzarli per definire il possibile ruolo di questi virus nella deregolazione di programmi di sviluppo/rigenerazione tessuto-specifici.
Disegno sperimentale: Le particelle virali sono isolate direttamente dai campioni di tumore derivati da paziente, ovvero da xenotrapianti tumorali ottenuti in topi immunosoppressi, utilizzando il protocollo originario di Rous (1911) modificato aggiungendo una fase di precipitazione mediante PEG ovvero mediante ultracentrifugazione. Le particelle virali così isolate sono quantizzate/caratterizzate mediante FACS e immunomicroscopia elettronica ed utilizzate per: 1. definire sequenza ed eterogeneità genetica del virus mediante sequenziamento Nanopore (Oxford Nanopore Technologies); 2. infettare/superinfettare colture di paraganglioma e di cellule normali in comparazione con ceppi noti di CMV. Le cellule infettate sono utilizzate per valutare effetti citopatici, (microscopia elettronica e confocale, sequenziamento del trascrittoma) e trasformanti (foci di trasformazione). IL sequenziamento analizzato in 2D dell'intero trascrittoma da cellule singole, effettuato in collaborazione con il CAST di Chieti e il Karolinska Institutet di Stoccolma, permetterà di identificare il fenotipo della cellula di origine del paraganglioma, che sarà confermato attraverso studi di immunofenotipizzazione in microscopia confocale e immuno-elettromicroscopia.
La tumorigenesi paraganglionica è un processo lento. Ammettendo un ruolo del CMV o di un virus simile nella sua eziopatogenesi e considerando che CMV muta frequentemente, si può anticipare che i livelli di variazione delle sequenze virali siano alti. Infatti, DNA di CMV è facilmente identificabile in tessuti di PGL tramite ibridazione in situ, ma è difficilmente rilevabile con tecniche basate su estensione di sequenza (PCR, NGS). La nostra strategia per risolvere questo problema è basata sul protocollo originale del 1911 sviluppato da Francis Peyton Rous combinato con precipitazione PEG per isolare particelle virali da campioni freschi di PGL/PDX e da urina di pazienti o topi xenotrapiantati. Particelle virali isolate da campioni di PGL/PDX (0.5 cm3) e da urina (9 ml per i pazienti, 300 ¿l per i topi xenotrapiantati) sono fenotipizzate e quantizzate mediante FACS utilizzando una strategia di gating che seleziona particelle gB(+) nel range dimensionale del CMV e contenenti DNA, sottoposte poi a verifica ultrastrutturale. Aliquote delle suddette particelle sono utilizzate, presso i nostri collaboratori del CAST di Chieti, per: i) proteomica, via analisi spettrometrica LC-MS/MS con un sistema cromatografico Proxeon EASY-nLCII (ThermoFisher Scientific) accoppiato ad uno spettrometro di massa Maxis HD UHR-TOF (BrukerDaltonics GmbH); ii) analisi dell¿intera sequenza virale mediante sequenziamento di quarta generazione (Oxford Nanopore) e validazione con PCR.
Particelle virali isolate e caratterizzate come sopra sono usate per infettare/superinfettare cellule non-neoplastiche di linea fibroblastica, pericitica, endoteliale, epiteliale come pure cellule di PGL e altri tipi cellulari emergenti dall¿analisi di scRNA-seq. La replicazione virale è valutata attraverso l'analisi degli effetti citopatici e l'espressione di antigeni virali precoci/tardivi mediante WB, immunofluorescenza confocale e PCR (regione conservata di gB). I tassi proliferativi sono valutati mediante marcatura per Ki67 e analisi FACS. Il potenziale oncogeno del virus è valutato mediante saggi di formazione di colonie su agar soffice, valutazione dell¿attività telomerasica (TRAPEZE Telomerase kit, Chemicon) e analisi trascrizionale di pathways implicati nell'infezione/replicazione virale. Gli effetti citopatici e trascrizionali sono comparati a quelli ottenuti con CMV VR1814. L'invasività in vitro e la formazione di tumori sono valutate mediante xenotrapianto di cellule infettate/non-infettate in topi NSG. I profili trascrizionali e le modificazioni epigenetiche sono analizzate su piattaforma Illumina allo IOV, Padova (Dr.ssa Francesca Schiavi). Le librerie sono preparate usando diversi kits (TruSeq Stranded Total RNA Library Prep kit, TruSeq DNA Methylation and TruSeq ChIP Library Preparation Kits). Le corse di sequenziamento sono su piattaforma NextSeq-550 (Illumina). Nel progetto si effettueranno analisi bioinformatiche per identificare effetti differenziamento-specifici e generali dell¿infezione su geni relevanti per l'effetto Warburg, per il differenziamento della cresta neurale e per la regolazione di CMV MIEP.
Supponiamo che l'infezione con virus simili al CMV deregoli il programma differenziativo della cresta neurale, abrogando il controllo fisiologico della crescita ed istigando cellule paranganglioniche di tipo staminale allo sviluppo aberrante in direzione sia vascolare che and neurale, con incessante formazione di tessuto paraganglionico più o meno differenziato. Questo processo potrebbe dipendere da una riorganizzazione metabolica ed epigenetica indotta dall'infezione virale in un contesto mutazionale dell'ospite che precondizioni alla stabilizzazione pseudoipossica degli HIFA. L'infezione dovrebbe insistere su una presunta cellula staminale del PGL e sul suo microambiente. Sinora, la mancanza di un approccio sistematico all'identificazione della cellula di origine del PGL e delle interazioni che, con il differenziamento, si sviluppano nel microambiente di questo tumore non hanno permesso di verificare la nostra ipotesi.
Riteniamo che per prevenire e curare il paraganglioma/feocromocitoma sia necessario conoscere e comprendere la struttura e la complessità genetica del virus che infetta questo tipo di tumori rispetto ad altri ceppi noti di CMV. Dobbiamo anche comprendere la diversità biologica e genetica dei tipi cellulari che formano il tessuto tumorale in relazione al virus che li manipola e sfrutta per compiere il proprio ciclo replicativo. Anticipiamo che determinate mutazioni possano favorire l'oncogenesi virale. D'altra parte, l'infezione fornisce un bersaglio di terapie selettive ovvero potrebbe permettere interventi preventivi basati sullo sviluppo di vaccini. Il progetto, nel suo insieme, avrebbe un impatto generale sul cancro, in quanto proponiamo il paraganglioma/feocromocitoma come un nuovo modello di cancerogenesi umana, in cui si intersecano variabilità genetica, sviluppo embrionale ed infezione virale.