Molte malattie neurodegenerative (i.e. Alzheimer e Parkinson) sono accomunate dalla presenza di disfunzioni nel ripiegamento delle proteine che portano all¿accumulo di aggregati di proteina in vari compartimenti cellulari ed extracellulari.
Il lievito S. cerevisiae è uno dei sistemi modello più usati per studi in medicina molecolare. La modellizzazione di malattie neurodegenerative umane in questo semplice organismo ha già dimostrato l'incredibile potenza del lievito per svelare i meccanismi complessi e le vie che nascondono queste patologie portando all'identificazione di diversi potenziali target terapeutici e farmaci per molte malattie.
Diverse funzionalità associate a queste malattie, come la formazione di aggregati di proteine, lo stress ossidativo e le caratteristiche dell'apoptosi, sono state ricreate fedelmente nel lievito, consentendo di trarre vantaggio da questo potente modello per eseguire rapidamente screening genetici e di composti.
La FENIB (familial encephalopathy with neuroserpin inclusion bodies), è una rara e fatale malattia neurodegenerativa caratterizzata dalla presenza di corpi di inclusione costituiti da polimeri di neuroserpina. Nonostante i vari modelli animali e cellulari sviluppati finora, il meccanismo di tossicità dei polimeri di neuroserpina non è chiaro. In questo progetto ci proponiamo di creare un modello cellulare in lievito per lo studio della FENIB allo scopo di capire meglio l¿effetto cellulare e molecolare dell¿accumulo di polimeri di neuroserpina. Verrà valutato l¿impatto dell¿espressione della neuroserpina e delle sue forme mutate sullo stress ossidativo e sulla fisiologia di organelli cellulari quali il reticolo endoplasmatico ER e i mitocondri.
Una migliore comprensione dei meccanismi molecolari responsabili della tossicità dei polimeri, potrà essere la base per la ricerca di misure correttive tramite alterazione del metabolismo o somministrazione di molecole mirate.
Il lievito rappresenta un modello di studio conveniente per molte malattie umane, compreso il cancro e le malattie neurodegenerative (Guaragnella et al., 2014; Oliveira et al., 2017).
Questo microrganismo cresce velocemente su substrati semplici e si presta a manipolazioni genetiche classiche e molecolari. Sono a disposizione piattaforme per lo studio ¿genome wide¿, collezioni di mutanti e di geni di fusione con la GFP (Green Fluorescence Protein) che consentono di visualizzare i diversi compartimenti cellulari in seguito a varie perturbazioni:
Negli ultimi 20 anni, il lievito si è affermato anche come modello per lo studio della morte cellulare programmata e l¿invecchiamento. A questo proposito, esistono in lievito tre modelli principali di invecchiamento: l¿invecchiamento replicativo (RLS), che si basa sulla possibilità di ogni cellula madre di originare un limitato numero di cellule figlie, l¿invecchiamento cronologico (CLS) consente di misurare la sopravvivenza cellulare in uno stadio di attività post-mitotica e può essere correlato all¿invecchiamento di tessuti post-mitotici e di cellule di mammifero che non si dividono, come i neuroni, o che sono caratterizzate da una lunga fase di non-divisione (Mirsola et al., 2013). Infine, l¿invecchiamento clonale (ClLS) permette di studiare lo sviluppo delle cellule senza che esse vengano influenzate dai segnali acido-base emessi dalle colonie vicine (Mazzoni et al., 2012).
Diverse proteine umane coinvolte in patologie sono state espresse con successo in lievito, ricreando un ambiente per studiare i meccanismi di base coinvolti nella risposta cellulare.
Nel nostro laboratorio, per esempio, è stata studiata l¿espressione di varie proteine umane quali l¿oncosoppressore p53, le porine VDAC1, 2 e 3 e loro forme mutate (Muscolini et al., 2011; Palermo et al., 2013; De Pinto et al., 2010; Palermo et al., 2010).
L¿espressione della neuroserpina umana nel lievito Pichia pastoris è stata tentata con lo scopo di produrne una grande quantità per studiarne la struttura (Kaiserman et al., 2014), ma ad oggi non è mai stato studiata la risposta cellulare a questa espressione.
Lo scopo di questo progetto è quello di creare un nuovo modello cellulare per lo studio della FENIB nel lievito Saccharomyces cerevisiae. L¿uso degli strumenti genetico-molecolari che abbiamo a disposizione, insieme con la facilità di coltivazione e la disponibilità di ceppi mutanti dove esprimere sia la proteina selvatica che quelle recanti le mutazioni isolate da pazienti FENIB, potrebbero fornire velocemente alcune risposte sul meccanismo di tossicità. In particolare, sarà possibile valutare gli effetti dell¿espressione delle neuroserpine selvatiche e mutanti sull¿invecchiamento, lo stress ossidativo e la morte cellulare programmata. Questi studi, affiancanti a studi su modelli animali, potrebbero pertanto accelerare i tempi per giungere alla conoscenza dei meccanismi molecolari alla base di questa patologia.
Guaragnella N, Palermo V, Galli A, Moro L, Mazzoni C, Giannattasio S. The expanding role of yeast in cancer research and diagnosis: insights into the function of the oncosuppressors p53 and BRCA1/2 FEMS Yeast Res. 2014 Feb;14(1):2-16
Oliveira AV, Vilaça R, Santos CN, Costa V, Menezes R. Exploring the power of yeast to model aging and age-related neurodegenerative disorders. Biogerontology. 2017 Feb;18(1):3-34
Muscolini M, Montagni E, Palermo V, Di Agostino S, Gu W, Abdelmoula-Souissi S, Mazzoni C, Blandino G, Tuosto L. The cancer-associated K351N mutation affects the ubiquitination and the translocation to mitochondria of p53 protein J Biol Chem. 2011 Nov 18;286(46):39693-702
Palermo V, Mangiapelo E, Piloto C, Pieri L, Muscolini M, Tuosto L, Mazzoni C. p53 death signal is mainly mediated by Nuc1(EndoG) in the yeast Saccharomyces cerevisiae FEMS Yeast Res. 2013 Nov;13(7):682-8
De Pinto V, Guarino F, Guarnera A, Messina A, Reina S, Tomasello FM, Palermo V, Mazzoni C Characterization of human VDAC isoforms: a peculiar function for VDAC3? Biochim Biophys Acta. 2010 Jun-Jul;1797(6-7):1268-75.
Reina S, Palermo V, Guarnera A, Guarino F, Messina A, Mazzoni C, De Pinto V. Swapping of the N-terminus of VDAC1 with VDAC3 restores full activity of the channel and confers anti-aging features to the cell. FEBS Lett. 2010 Jul 2;584(13):2837-44.
Kaiserman D, Hitchen C, Levina V, Bottomley SP, Bird PI. Intracellular production of recombinant serpins in yeast. Methods Enzymol. 2011;501:1-12
Mirisola MG, Braun RJ, Petranovic D. Approaches to study yeast cell aging and
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Mazzoni C, Mangiapelo E, Palermo V, Falcone C. Hypothesis: is yeast a clock
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