La proteina DOT1L è una metiltransferasi istonica, che usando come cofattore la S-(5¿-adenosil)-L-metionina (SAM), catalizza la metilazione della lisina 79 sull¿istone H3, associata generalmente ad attivazione trascrizionale. Tuttavia DOT1L sembra essere coinvolto anche nella patogenesi di alcune forme leucemiche, denominate leucemia mieloide linfoide (MLL), dove pare che la proteina DOT1L venga reclutata ectopicamente in seguito al riarrangiamento di un gene chiamato MLL. Sembra infatti che, a causa della traslocazione cromosomica 11q23, il gene MLL venga trasferito ad un locus genico diverso, determinando la sostituzione nella proteina che ne deriverà della porzione C-terminale con diversi possibili partner proteici, per esempio AF4 e AF10, in grado di reclutare DOT1L che eserciterà la sua azione metiltrasferasica sui target di MLL, come il gene HOX, coinvolto nella regolazione della ematopoiesi.
L¿inibizione selettiva di DOT1L sembrerebbe un valido approccio farmacologico nei pazienti oncologici, pertanto, con il presente lavoro si pone come obiettivo la progettazione razionale di inibitori della proteina DOT1L mediante l'uso di metodiche computazionali: Molecular Docking, 3-D QSAR (3-D Quantitative Structure-Activity Relationship) e COMBINE (COMParative BINding Energy). Il primo permetterà di avere un'idea della binding mode dei ligandi all'interno della tasca recettoriale, la 3-D QSAR cercherà una relazione quantitativa tra le strutture delle molecole note e la loro attività biologica per predire poi le attività di nuovi composti. La COMBINE studierà le interazioni molecola-recettore, dove noto e disponibile in Protein DataBank (PDB), con il vantaggio dell'analisi mirata agli specifici residui amminoacidici all'interno del sito attivo che prendono parte alla formazione del complesso.Gli inibitori che verranno progettati e che verranno predetti promettenti dalla 3-D QSAR in termini di attività biologica, verranno poi sintetizzati e sottoposti a saggi biologici.
L'inibizione chimica di proteine coinvolte nelle vie di segnalazione che mediano cambiamenti della cromatina costituiscono una strategia emergente per il trattamento di condizioni patologiche in cui è presente un¿alterazione dell'espressione genica. Poiché il reclutamento di DOT1L su loci aberranti è spesso la causa della leucemia linfoide e mieloide (MLL), la ricerca di inibitori di DOT1L sembra essere un approccio promettente per la terapia farmacologica. Lo sviluppo di inibitori di DOT1L strutturalmente divergenti progredisce lentamente. Sulla base della struttura del cofattore naturale di DOT1L, negli ultimi anni, sono stati progettate varie molecole che potenzialmente possono inibire in modo SAM-competitivo. In letteratura sono presenti alcuni studi sull'attività di questi inibitori e uno di essi, EPZ-5676, sviluppato da Epizyme, ha terminato la fase di sperimentazione pre-clinica.
Tuttavia i dati disponibili ad oggi non sono molti e tra gli inibitori testati, quelli che hanno valori di attività promettenti, mostrano numerosi limiti dal punto di vista farmacocinetico. Si pone quindi la necessità di individuare molecole con buona potenza, selettività e un profilo farmacocinetico accettabile. Lo studio, la caratterizzazione strutturale, l'individuazione del meccanismo catalitico, la crescente comprensione della complessa rete di interazioni e le conseguenze sulla regolazione dell'espressione genica di DOT1L, negli ultimi anni hanno permesso la messa a punto di potenziali inibitori che rappresentano la base per il futuro sviluppo di farmaci per la terapia della leucemia mieloide-linfoide dovuta al riarrangiamento del gene MLL.
Lo scopo di questo progetto è quello, mediante l'applicazione di metodiche di molecular docking, 3-D QSAR e COMBINE, di studiare le regioni del sito catalitico in cui gli inibitori si posizionano con maggiore probabilità, per approfondire la conoscenza delle precise interazioni chimiche esistenti tra gli inibitori e il sito attivo dell'enzima ed individuare come i cambiamenti strutturali che differenziano queste molecole influenzino la variazione dell'attività, allo scopo di elaborare dei modelli sperimentali quanto più possibile affidabili e robusti che permettano di predire con un ristretto margine di errore l'attività di nuovi potenziali inibitori. I modelli sono elaborati mediante le molecole di inibitori di cui sono disponibili le strutture cristalline, sono poi validati mediante un set di molecole presenti in letteratura, sia mediante 3D QSAR che COMBINE.Fino ad oggi in letteratura sono presenti inibitori caratterizzati dalla presenza nella struttura di una porzione adenosinica o similadenosinica, in cui possono essere presenti variazione degli atomi del ribosio o dell¿adenina, e questo perché sono inibitori competitivi della SAM, cioè sono composti che strutturalmente devono mimare la S-adenosil-L-metionina, cofattore di DOT1L. Tuttavia studi preliminari basati sulla tecnica della QSAR hanno portato all'osservazione che in realtà questo gruppo adenosinico ritenuto inizialmente fondamentale per la competizione con il cofattore SAM, risulta non influente sull¿attività degli inibitori DOT1L già noti e presenti in letteratura.Mediante l'approccio 3-D QSAR si otterranno delle mappe di contorno che ci permetteranno di visualizzare quelle che sono ritenute dal modello matematico le porzioni fondamentali per l'attività biologica dei composti, queste mappe ci aspettiamo siano sovrapponibili alle mappe fornite dalla QSAR.La COMBINE invece ci dara informazioni circa l'interazione di residui della proteina con l'inibitore, anche qui se le osservazioni fatte con la QSAR saranno confermate ci si aspetterà che la COMBINE non rilevi nessuna interazione particolarmente forte tra la struttura adenosinica e i residui circostanti la stessa porzione.
Inoltre fondamentale sarà l¿utilizzo del molecular docking per indagare anche il binding mode più probabile delle strutture di nuova progettazione, per studiare se questi binding mode sono compatibili con quelle disponibili e ricavabili dalle banche date, come per esempio il PDB, Protein Data Bank.L'incrocio dei dati ottenuti permetterà quindi la valutazione dell'affidabilità di questi modelli per poi utilizzarli eventualmente per la predizione delle attività del set di molecole derivanti da quelle già disponibili, ma appunto prive della porzione nucleosidica, per comprendere come si modifica l¿attività in mancanza di una porzione rilevante di questi derivati della S-adenosil-L-metionina. L'innovatività di questo progetto risiede quindi nel tipo di inibitori che si punta a progettare, sviluppare e sintetizzare, oltre che al metodo, in quanto i vari approcci saranno tutti automatizzati in linguaggio Python, protocollo che se si rivelerà un buon protocollo verrà reso noto e di dominio pubblico.