Il manganese (Mn) è un oligoelemento essenziale per la vita degli organismi essendo cofattore di enzimi implicati in importanti processi fisiologici. Carenza e eccesso di Mn possono avere effetti deleteri per l'organismo: la prima determina ridotta attività enzimatica mentre l'accumulo di Mn causa una grave patologia di tipo parkinsoniano detta manganismo.
Nel Sistema Nervoso Centrale (SNC) dei mammiferi, il Mn si accumula preferenzialmente nei gangli basali, soprattutto nella substantia nigra pars compacta e la tossicità da Mn influenza non solo il sistema dopaminergico ma anche quelli colinergico, GABAergico e glutamatergico.
Le attività agricole e industriali determinano l'aumento dei livelli di Mn nell'ambiente e l'uso nelle benzine di additivi ricchi di Mn causa il rilascio di Mn nell'aria.
Il presente progetto si propone di utilizzare esemplari adulti di PZ per studiare l'effetto dell'esposizione a dosi subletali di metilciclopentadienil-tricarbonil-manganese (MMT), un composto organico del Mn aggiunto alla benzina verde, sui sistemi colinergico e dopaminergico tubercolo-telencefalico (corrispondente al sistema nigro-striato dei mammiferi). Studi preliminari evidenziano che l'esposizione di embrioni di PZ a dosi subletali (100 uM) di MMT influenza il sistema dopaminergico e il comportamento della larva.
Lo scopo del presente progetto è valutare nel PZ adulto l'effetto dell'esposizione alle stesse concentrazioni di Mn sul SNC mediante un approccio multidisciplinare basato sia su studi comportamentali sia sull'analisi di parametri neurochimici. I test comportamentali che verranno condotti consistono in paradigmi sperimentali già testati con successo su modelli di teleostei, atti a valutare gli stati di ansia, attività motoria, memoria e apprendimento. L'encefalo e il midollo spinale saranno poi analizzati per valutare eventuali variazioni dei parametri neurochimici correlati ai sistemi dopaminergico e colinergico dai quali dipendono i comportamenti testati.
L'utilizzo di modelli teleostei nella ricerca scientifica ha avuto negli ultimi decenni un forte incremento e il PZ è la specie modello più utilizzata tra i pesci. La direttiva 2010/63/EU, che in Europa disciplina l'utilizzo degli animali ai fini scientifici, si basa sul principio delle tre R (Reduction, riduzione; Refinement, perfezionamento e Replacement, sostituzione) formulato nel 1959 da Russel e Burch [65] per fornire indicazioni ai ricercatori che fanno uso di modelli animali nelle proprie ricerche. Il principio della Reduction impone di ridurre al minimo il numero di animali sperimentali e Replacement indica la sostituzione di modelli animali con metodi alternativi, come studi in vitro, approcci molecolari o con modelli matematici e computazionali [66]. In questo ambito viene riconosciuto il principio del cosiddetto Relative Replacement che invita, quando possibile, ad utilizzare modelli animali con un sistema nervoso più semplice, poiché si presuppone che essi siano caratterizzati da una minore capacità di sofferenza. Per quanto il dibattito scientifico sull'effettiva capacità dei pesci di percepire dolore sia ancora aperto [67-77], la sostituzione di modelli animali mammiferi con modelli teleostei si configura come Relative Replacement ed è fortemente caldeggiata dalla normativa vigente. In questo senso, il progetto proposto intende essere fortemente innovativo, poiché applica ai pesci teleostei l'approccio multidisciplinare basato su analisi comportamentali e neurochimiche classicamente applicato a topi e ratti.
Lo studio proposto permetterà un avanzamento delle conoscenze relative all'effetto dell'esposizione a concentrazioni subletali di MMT (100 uM) in un modello animale di vertebrato che condivide molte caratteristiche di base con i mammiferi . Come sopra dettagliato, MMT è un composto ad alto contenuto di Mn aggiunto ai carburanti. Si valuterà se l'esposizione a MMT influenzi l'attività motoria e le funzioni cognitive dell'animale e se essa determini alterazioni dei sistemi dopaminergico e colinergico nei soggetti sperimentali. Un gruppo di animali sarà esposto a MMT 100 uM durante la fase embrionale (5-96 hpf) mentre un altro gruppo sarà soggetto all'esposizione allo stadio adulto per un periodo di 2 mesi (da 10 mesi a 1 anno di età ). Animali non esposti a MMT costituiranno i controlli sperimentali.
Tutti i soggetti sperimentali a un anno di età saranno sottoposti ai test comportamentali nei quali saranno valutati lo stato di ansia, la modalità di esplorazione dell'ambiente, la performance di nuoto, le capacità di orientamento e memorizzazione spaziale e l'apprendimento. Successivamente, i soggetti sperimentali saranno eutanizzati per condurre le analisi molecolari che permetteranno di valutare l'impatto dell'esposizione a MMT sui sistemi dopaminergico e colinergico, principali sistemi compromessi nelle patologie parkinsoniane e correlati ai parametri comportamentali testati. Lo studio dell'esposizione a MMT sia durante gli stadi embrionali che nell'adulto permetterà di valutare la diversa sensibilità dell'organismo a tale composto in relazione allo stadio di sviluppo e di valutare se gli effetti di un'esposizione in fase embrionale persistano nel soggetto adulto.
Lo studio degli effetti del MMT ha rilevanza sia in ambito ecologico che per la salute dell'uomo. Lo sversamento di carburanti nell'ambiente immette MMT nell'ecosistema e la combustione dei carburanti nei motori a scoppio delle autovetture espone quotidianamente l'uomo all'inalazione dei vapori di MMT contenenti alta percentuale di Mn.
Lo studio proposto può essere configurato come ricerca traslazionale, in grado di trasferire le conoscenze acquisite ad altre specie, uomo compreso. Per quanto evolutivamente distanti, teleostei e mammiferi condividono caratteristiche molecolari, cellulari e, in parte, anche neuroanatomiche che sono piuttosto conservate nei vertebrati.