I poliidrossialcanoati (PHA) sono tra i migliori candidati per la produzione della cosiddetta bioplastica in quanto vengono sintetizzati durante il processo fermentativo da diversi tipi di batteri, in mancanza di un nutriente fondamentale quale l¿azoto. Per il recupero è necessario estrarli dalla cellula batterica e purificarli, processo che incide notevolmente sui costi complessivi della produzione del polimero. Obiettivo della presente sperimentazione è lo studio di un nuovo processo di dowstream del PHA prodotto da colture microbiche miste che partendo dai risultati riportati in letteratura punta poi ad un miglioramento del processo attraverso la ricerca di nuove alternative. I processi più diffusi per l¿estrazione dei PHA dalla cellula sono l¿estrazione con solvente, cloroformio, e digestione della biomassa non contenente polimero da parte di un agente chimico quale l¿idrossido di sodio. Punto fondamentale del presente studio è l'uso di solventi "green" quali i fluidi supercritici da impiegare per la rottura delle pareti e membrane cellulari, facilitando il recupero e la purificazione del polimero. Tale processo può essere considerato ecosostenibile e in grado di fornire un prodotto ad elevata purezza, con una massa molare soddisfacente e un buon recupero. Per la standardizzazione della procedura di estrazione verrà utilizzata la CO2 supercritica per il suo basso costo, la sua reperibilità e i bassi tempi di reazione.
Al fine di ottenere una procedura di recupero in CO2 supercritica efficiente e standardizzata, verranno valutati diversi parametri: concentrazione della biomassa, T e P della CO2 supercritica e durata del trattamento ad alta P. Verrà proposto anche l'uso di un trattamento enzimatico sulla biomassa non contenente polimero, a valle del processo ad alta pressione, con idrolasi specifiche (peptidasi e glicosidasi) al fine di ottimizzare la resa e la purezza del PHA.
Recentemente i fluidi supercritici (SCFs) si sono dimostrati solventi di grande interesse per numerosi processi biotecnologici. L'applicazione di SCFs è semplice, relativamente poco costosa, e, cosa più importante, non nociva per la struttura e funzione degli enzimi, proteine strutturali e polimeri biologici(1) . La CO2 supercritica (SC-CO2) è il fluido più comunemente usato e la sua bassa temperatura e pressione critica (31,1 ° C, 73 bar) la rendono un solvente ideale dal punto di vista applicativo (2). Ad oggi, l'applicazione di SCFs per la lisi cellulare è stata testata su diversi lieviti e su alcuni ceppi di batteri (3) ma non ci sono studi di letteratura che riportano il trattamento di SC-CO2 su cellule microbiche miste (MMC) per l'estrazione di PHA. Il processo di lisi cellulare (cell disruption) prevede inizialmente la penetrazione della SC-CO2 nelle nelle cellule (4). A seguito della espansione del gas all'interno delle cellule (nello step di depressurizzazione) la parete cellulare si disintegra e rilascia il contenuto intracellulare (granuli di PHA) nell'ambiente di reazione. La tecnica è relativamente semplice e può essere facilmente scalata a livello industriale (5).
In tale ambito, il presente progetto intende proporre un trattamento di downstream non convenzionale sulla biomassa fermentata utilizzando un approccio integrato che preveda un trattamento con SC-CO2 e successivamente una serie di trattamenti enzimatici per massimizzare il recupero e la purezza del PHA. Sulla base di una intensa attività sperimentale condotta negli anni precedenti dal gruppo di ricerca del Prof. Majone sono state messe a punto sperimentazioni su scala di laboratorio e pilota (presso ATS S.r.l., Alto Trevigiano Servizi, Treviso) con substrato sintetico (acetato) o con FORSU (Frazione Organica del Rifiuto Solido Urbano) fermentata, mirati alla produzione di biomassa ad alto contenuto di PHA intracellulare. Tale biomassa rappresenta il materiale di partenza su cui si intende lavorare per sviluppare procedure non convenzionali di downstream processing basate sull'uso di fluidi supercritici. Le prestazioni delle varie prove di estrazione verranno quantificate in termini di: purezza del PHA estratto, (%) di recupero del PHA, composizione monomerica del PHA (PHBV) epeso molecolare del PHA estratto. I trattamenti enzimatici che verranno realizzati dopo la lisi cellulare mediante fluidi supercritici avranno l'obiettivo di idrolizzare le componenti macromolecolari delle pareti e membrane cellulari e facilitare l'estrazione del polimero. Punto fondamentale dello studio è l'uso di solventi non alogenati per il recupero e la purificazione del polimero in modo da rendere il processo ecosostenibile, in grado al contempo di fornire un prodotto ad elevata purezza, con una massa molare soddisfacente e un buon recupero.
1. Erdogan Kiran, Supercritical fluids and polymers ¿ The year in review ¿ 2014, The Journal of Supercritical Fluids Volume 110, April 2016, Pages 126-153
2. Ž.Knez, E.Marko¿i¿, M.Leitgeb, M. Primoži¿, M. Knez Hrn¿i¿, M.Škerget, Industrial applications of supercritical fluids: A review, Energy Volume 77, 1 December 2014, Pages 235-243
3. Khosravi-Darani K., Vasheghani-Farahani E., Shojaosadati S.A., Yamini Y., 2004. Effect of process variables on supercritical fluid disruption of Ralstonia eutropha cells fo poly(R-hydroxybutyrate) recovery. Biotechnol. Pro., 20:1757-1765
4. Maja ¿olnik, Mateja Primoži¿, Željko Knez, and Maja Leitgeb, Use of Non-Conventional Cell Disruption Method for Extraction of Proteins from Black Yeasts, Front Bioeng Biotechnol. 2016; 4: 33
5. Ho Mu Lin, Zhiying Yang, and Li Fu Chen, An improved method for disruption of microbial cells with pressurized carbon dioxide, Biotechnol. Prog., 1992, 8 (2), pp 165¿166