La resistenza agli antibiotici, principalmente dovuta a batteri Gram-negativi multiresistenti, è un fenomeno globale che risulta aggravato da un uso inappropriato di questi farmaci. Gli antibiotici ad oggi disponibili sono inefficaci nel contrastare queste infezioni, per cui è stato necessario reintrodurre farmaci da tempo inutilizzati a causa dei loro gravi effetti collaterali, come la colistina. Tuttavia, negli ultimi anni è stata riscontrata l'insorgenza di ceppi di P. aeruginosa colistina-resistenti a causa di modificazioni attive del lipide A catalizzate dall'enzima undecaprenil fosfato transferasi ¿-4-amino-4-deossi-L-arabinosio (ArnT), che lega lo zucchero cationico 4-ammino-4-deossi-L-arabinosio (L-Ara4N) al lipide A lipopolisaccaridico. Allo scopo di identificare piccole molecole in grado di inibire l'enzima ArnT, nota la sua struttura cristallografica, è stato effettuato lo screening in silico di una libreria in house di prodotti naturali. Dall'analisi computazionale sono state selezionate 18 molecole e l'ent-beyer-15-en-18-O-ossalato, isolato dalla pianta Fabiana densa var. ramulosa, è risultato il composto hit in grado di inibire maggiormente la crescita batterica in presenza di colistina, sottolineando il ruolo fondamentale del gruppo acido in posizione C-18 dello scaffold tetraciclico ent-beyerenico. Al fine di definire la relazione struttura-attività (SAR) del composto hit, l'obiettivo del progetto prevede il disegno razionale di una prima generazione di derivati semisintetici a partire dallo Stevioside, diterpene glicosidico caratterizzato da uno scaffold ent-kaurenico e candidato ideale grazie alla sua affinità strutturale con lo scaffold ent-beyerenico.
L'obiettivo primario che il progetto si propone è il superamento della resistenza alla colistina, antibiotico di ultima istanza per il trattamento delle infezioni polmonari da P.aeruginosa, così da poter ottimizzare le terapie ad oggi note nella pratica clinica e combattere l'attuale emergenza globale. La realizzazione del progetto si articola in tre fasi principali che vedono: la progettazione di una nuova serie di derivati semisintetici della Stevia, simulazioni di docking molecolare rispetto al cristallo della proteina ArnT, e in ultima analisi, la realizzazione di saggi di citotossicità in vitro o in vivo. In particolare, la prima fase prevede il disegno e la sintesi di analoghi diterpenici semisintetici a partire dallo Stevioside, strutturalmente affine con il composto hit e dotato di attività coadiuvante la colistina al fine di potenziare l'attività antibatterica di quest'ultima. La caratterizzazione di tali composti include l'impiego di tecniche di spettrometria di massa ad alta risoluzione (ESI-HRMS) e di spettroscopia di risonanza magnetica nucleare monodimensionale (1H- e 13C-NMR) e bidimensionale (COSY, NOESY, HMBC, HSQC). Inoltre, data la presenza di numerosi centri chirali, la caratterizzazione richiede la misurazione quantitativa dell¿attività ottica (potere rotatorio specifico). La seconda fase prevede simulazioni di docking molecolare mediante l¿utilizzo di FRED (OpenEye Scientific Software 3.3.0.3) analizzando sia le modalità di binding che l'affinità teorica. Infine, la terza fase del progetto consiste nell'attuazione di saggi in vitro su ceppi di laboratorio (PA14 colR5) e di isolati clinici di P. aeruginosa colistina-resistenti (MG75 e ND76) al fine di valutare la variazione della crescita batterica e la MIC della colistina in presenza di questi composti. Successivamente verrà anche valutata la citotossicità in vitro o in vivo dei composti, impiegando linee cellulari epiteliali bronchiali (16HBE e CFBE) isolate da pazienti con fibrosi cistica. Mediante il saggio colorimetrico MTT (bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio), infatti, sarà possibile misurare l'attività degli enzimi che riducono l'MTT a formazano, conferendo alla sostanza un colore blu/violaceo.