Il presente lavoro è parte di un progetto che mira a caratterizzare i meccanismi molecolari in cui è coinvolto il dimetilfumarato (DMF), composto recentemente approvato come trattamento curativo per la sclerosi multipla (SM). In base agli ultimi lavori presentati in letteratura, il DMF dovrebbe esercitare effetti anti-infiammatori sulle cellule del sistema immunitario, riducendone lo stress ossidativo; tuttavia, la causa di questa sua azione terapeutica è attualmente sconosciuta.
I nostri dati preliminari hanno dimostrato che il DMF aumenta notevolmente l'assorbimento della Ferritina (proteina responsabile del trasporto del ferro nelle cellule) su colture microgliali: secondo la nostra ipotesi, questo massiccio fenomeno è dovuto ad una sovraespressione del recettore della transferrina (CD71, responsabile dell'internalizzazione della Ferritina dall'ambiente extracellulare), causata proprio dal DMF. Questa nostra osservazione, completamente assente in letteratura sinora, potrebbe collegare due fatti apparentemente molto distanti fra loro: da una parte, come già detto, gli effetti neuroprotettivi che il DMF esercita sul sistema immunitario, dall'altra la nota disregolazione del metabolismo del ferro nella microglia del cervello nei pazienti sclerotici. Secondo le nostre congetture, infatti, il DMF ristabilirebbe l'uptake del ferro nella microglia danneggiato dalle lesioni tipiche della SM, agendo quindi sia come un neuroprotettore che come regolatore del metabolismo del ferro.
L'azione di questo composto sembra essere altamente specifica per l'assorbimento della ferritina nelle microglia: questa ricerca si concentrerà sulla diffusione di onde sferiche che sono attivate solo dalla contemporanea presenza di DMF e Ferritina. Il nostro scopo è osservare queste onde su colture tridimensionali che meglio rappresenteranno la natura fisiologica del problema, e verificare che siano dovute a un fenomeno dipendente dal calcio.
Nelle prime parti di questo progetto abbiamo stabilito una correlazione diretta tra DMF e metabolismo del ferro: in base ai nostri dati sperimentali, il DMF sarebbe in grado di ripristinare un'internalizzazione del ferro aumentando l'espressione del CD71 (recettore della Transferrina e, in particolare, della Ferritina) sulla loro superficie, favorendo così l'assorbimento della ferritina. Inoltre, l'uptake di questa proteina mediato da questo composto è distribuito in modo omogeneo nel citoplasma, in un modo molto diverso da quello classico, riportato in letteratura, in vescicole discrete (PNAS 107:3505-3510, 2010). È molto importante notare che in letteratura finora non c'è traccia della connessione tra DMF e ferro: approfondendo ulteriormente questo fenomeno, potremmo essere in grado di essere i primi a raggiungere questo importante risultato.
Oltre a ciò, abbiamo notato che il sistema Ferritina e DMF agisce come uno switch biofisico che porta alla creazione di onde sferiche che si propagano sulla superficie della soluzione, a partire dai soma microgliali fino a grandi distanze. Queste increspature e il massiccio assorbimento di Ferritina con il DMF sono due fenomeni altamente correlati ed entrambi dipendenti dal calcio, poiché la presenza del chelante del calcio Bapta-AM li spegne entrambi. Con la presente ricerca, capiremo il ruolo di queste increspature nel coinvolgimento del composto DMF sull'assorbimento di ferro. Ancora una volta, è notevole notare che in letteratura non si parla né di queste onde sferiche né della connessione tra Calcio, presenza di DMF e assorbimento di ferro.
Per conseguire queste misurazioni, due gruppi multidisciplinari nell'Istituto Italiano di Tecnologia Center for Life Nano Science (IIT CNLS @ Sapienza) collaboreranno a stretto contatto: uno è il gruppo di Biochimica (il cui leader è il prof. Alberto Boffi), specializzato nell'uso di Ferritine come nanovettori, l¿altro quello di neuroscienze (il cui leader è la prof.ssa Silvia Di Angelantonio). Monitoreremo i transitori di calcio nelle cellule sia in presenza che in assenza di composti DMF e Ferritina. Useremo la microglia murina primaria polarizzata in condizioni diverse (stati M0, M1 o M2) e su diversi supporti, in particolare in colture tridimensionali composte da hydrogel biocompatibili (Scientific reports, 2017, 7.1: 8499) che sono attualmente le più vicine alle vere condizioni fisiologiche. Possiamo fare affidamento sull'uso di una configurazione ottica "hand-made" di alto livello, costruita nei laboratori IIT CLNS, che abbiamo ottimizzato per eseguire ad alta risoluzione spaziotemporale la fluorescenza di calcio in grandi parti delle colture cellulari. Useremo inoltre colture cellulari tridimensionali, molto innovative e ancora poco usate per misure di questo tipo. Il nostro microscopio a fluorescenza ottimizzato per eseguire imaging di Calcio a campo ampio può essere esteso ad un approccio di imaging a volume ampio attraverso la modulazione di fase controllabile del percorso di rilevazione. Tale modulazione è ottenibile inserendo nel percorso di rivelazione una lente tunabile (TL), la cui lunghezza focale può essere controllata da computer, posizionata sul piano focale comune di due lenti convesse con uguali lunghezze focali. Quando la curvatura della lente tunabile cambia, la funzione di fase del telescopio e la convergenza del segnale rilevato sul piano della camera variano, rendendo possibile la scansione assiale del campione. In questa configurazione saremmo in grado di monitorare l'attività di migliaia di cellule in un ampio volume e con alta risoluzione spaziale, così da poter eseguire un'analisi statistica altamente significativa. Il LED, la camera e la TL saranno controllati da un Codice Matlab che abbiamo scritto per questo esperimento.
I dati verranno raccolti come una serie di frame catturati dalla fotocamera e salvati come file Matlab di matrici. Analizzeremo i dati grezzi con codici Matlab scritti da noi stessi, senza la manipolazione di alcun programma esterno. I vantaggi di questo approccio sperimentale sono molteplici. Grazie all'ampio campo di imaging controlleremo la propagazione di segnali ondulatori attraverso un vasto volume, ottenendo così il comportamento della dinamica collettiva di un gran numero di cellule in un ambiente tridimensionale che mimi al meglio la complessità del tessuto in vivo. Come si può notare, questa ricerca si basa su un approccio altamente multidisciplinare, in quanto entrambe le responsabili di questo progetto sono laureate in Fisica ma si dedicano allo studio dei processi Biologici: useremo quindi nozioni e metodi propri della biochimica, della biologia e della fisica per cercare di capire i meccanismi molecolari benefici del DMF su cellule microgliali.
Le prospettive future di questo lavoro mirano ad approfondire il ruolo del DMF sia come neuroprotettore che come regolatore del ferro.