L'iperossaluria primitiva di tipo 1 (PH1) è causata da un difetto dell'enzima perossisomiale epatico L-alanina:gliossilato aminotransferasi (AGT), dovuto alle mutazioni nel gene AGXT. Il difetto in AGT, che normalmente converte il gliossilato in glicina, determina un aumento del pool di gliossilato, che viene convertito in ossalato (scarsamente solubile) e precipita come ossalato di calcio causando il blocco renale. In assenza di trapianto di fegato e reni, la prognosi per i malati di PH1 è molto sfavorevole.
L'AGT è un'enzima che esiste in due varianti polimorfiche denominate allele maggiore (AGT-Ma) e allele minore (AGT-Mi). La variante AGT-Mi, presente nel 20% della popolazione, rispetto all'allele maggiore ha una doppia mutazione; P11L e I340M. Pur non essendo patogenica AGT-Mi ha un'attività catalitica significativamente più bassa rispetto ad AGT-Ma ed è associata ad una frequenza più alta (50%) nei pazienti affetti da PH1. Questo polimorfismo infatti potenzia l'effetto di molte altre varianti patogeniche conosciute che provocano misfolding e/o mistargeting dell'enzima, aggregazione o mancata attività catalitica. Nonostante le basi molecolari di questi effetti non siano del tutto chiari, è stato osservato che le due mutazioni presenti in AGT-Mi abbassano la stabilità termodinamica della proteina fino al limite inferiore compatibile con la sua funzione. Di conseguenza l'associazione con altra mutazione ha un'elevata probabilità di codificare per una AGT non funzionale causando PH1.
Lo scopo del presente progetto è quello di determinare la struttura tridimensionale dell'AGT-Mi, mediante cristallografia a raggi-X, per comprendere a livello molecolare le cause della minore stabilità di questa variante. La conoscenza dei dettagli strutturali dell'enzima sarà un elemento essenziale nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche per la cura della PH1 basate sull'uso di chaperonine molecolari e nella messa a punto di possibili terapie cellulari o geniche.
La risoluzione della struttura tridimensionale dell'AGT-Mi rappresenta il tassello mancante per la comprensione del complesso panorama conformazionale dell'AGT. Non è chiaro infatti se la tendenza ad aggregare delle mutazioni associate all'allele minore sia dovuta ad una perdita di struttura di alcune regioni specifiche o ad una diversa conformazione non nativa che modifichi la superficie esposta al solvente. D'altronde, negli ultimi anni sta emergendo sempre più chiaramente che le variazioni conformazionali e ordine/disordine giocano un ruolo chiave sia nell'omeostasi delle proteine PLP dipendenti, che nella regolazione delle eventuali funzioni secondarie (moonlighting functions), che spesso possono essere indotte o inibite mediante le cosiddette conformational drugs.
Apparentemente l'AGT è un enzima che si è evoluto per lavorare al limite tra stabilità termodinamica e funzione, questo sottile equilibrio tra stabilità strutturale e funzione enzimatica è ben descritto dal concetto di frustrazione nelle proteine [1]. Indubbiamente per l'allele maggiore dell'AGT è stato recentemente dimostrato che il PLP viene legato al sito attivo con una geometria distorta, il che favorisce la catalisi [si veda pub. N. 5 del responsabile della ricerca], eppure dall'analisi strutturale dell'AGT-Ma sembrerebbe che la frustrazione non sia limitata esclusivamente al sito attivo; per chiarire questo aspetto occorrerà dunque risolvere la struttura di AGT-Mi.
Dal confronto delle due strutture sarà infatti possibile capire quali sono le regioni coinvolte nel cambio conformazionale o nell'eventuale shift tra ordine e disordine, guidando così il disegno razionale di molecole che possano ripristinare o stabilizzare la conformazione funzionale della proteina.
Referenze:
1) Gianni S, Camilloni C, Giri R, Toto A, Bonetti D, Morrone A, Sormanni P, Brunori M, Vendruscolo M. Understanding the frustration arising from the competition between function, misfolding, and aggregation in a globular protein (2014) Proc Natl Acad Sci U S A. 111(39):14141-6