Klebsiella pneumoniae e Acinetobacter baumanni sono tra le specie batteriche maggiormente diffuse nell'ospedale e la presenza di ceppi endemici rende difficile il tracciamento e la distinzione tra eventi epidemici e sporadici. Lo sviluppo di metodi genomici che dalla ricerca arrivino "a letto del paziente" ha potenziali ricadute sul controllo degli episodi epidemici e sull'orientamento delle scelte terapeutiche mediante identificazione certa dei meccanismi di resistenza e quindi uso dei farmaci più adatti alla cura delle infezioni.
Questo progetto si propone di sperimentare un modello di implementazione della sorveglianza microbiologica del Laboratorio di Microbiologia Clinica del Policlinico Umberto I con l'analisi genomica in tempo reale degli isolati grazie all'utilizzazione di sequenziatori portatili e tecnologie a basso costo disponibili nel laboratorio dell'unità proponente.
Il confronto genomico tra ceppi sensibili e resistenti isolati da uno stesso paziente sotto trattamento antibiotico, permette di identificare in K. pneumoniae e A. baumanni in tempo reale, i meccanismi di resistenza e ridotta suscettibilità agli antibiotici ed inibitori di nuova generazione .
L'unità proponente ha costruito negli ultimi due anni una piattaforma tecnologica per la realizzazione della sequenza genomica mediante lo strumento Mk1C-MinIon della Nanopore Tecnologies istallato nel 2020 presso il Laboratorio di Virologia e Microbiologia Molecolare della Sapienza in viale Porta Tiburtina 28 a Roma. La genomica Nanopore rappresenta l'approccio più innovativo tra quelli disponibili per la diagnosi delle malattie infettive. Questo approccio offre l'analisi molecolare completa di cloni epidemici a costi più contenuti ma in una scala inferiore rispetto al sequenziamento massivo basato su tecnologia Illumina ed ha una affidabilità di sequenza al 99% per coperture superiori a 60x e al 97% per coperture 10x. La conferma di sostituzioni nucleotidiche in singolo gene di rilevanza clinica (per esempio una mutazione nel gene blaKPC che conferisce la resistenza a ceftazidime-avibactam) può richiedere conferma con sequenziamento Sanger per coperture più basse.
L'approccio WGS Nanopore è già utilizzato in tutto il mondo per la genomica batterica e la metagenomica e permette la determinazione della sequenza genomica completa di batteri anche non coltivabili, virus e funghi in poche ore e a costi contenuti e la possibilità di investigare l'intero apparato di resistenza (resistoma) e gli elementi che ne determinano il trasferimento (mobiloma), la rilevazione del tipo capsulare, isole di patogenicità, e altri marcatori di interesse. Abbiamo esperienza di sequenziamento in house sviluppato su alcuni episodi epidemici e di insorgenza di resistenza al ceftazidime-avibactam sotto trattamento del paziente. Recentemente (Marzo 2021) abbiamo ottenuto le sequenze genomiche di K. pneumoniae resistenti al ceftazidime-avibactam (Carattoli et al., 2021 AAC submitted) isolate al Policlinico Umberto I nel periodo Gennaio 2019 ad Aprile 2020. Per la specie A. baumannii il gruppo proponente ha recentemente utilizzato Nanopore WGS per tracciare infezioni in tempo reale confrontando i ceppi isolati in due reparti di terapia intensiva ed escludendo un outbreak inter-reparto (Carattoli et al., 2021 unpublished). Queste due esperienze hanno dimostrato la fattibilità dell'approccio WGS e le grandi potenzialità innovative e di avanzamento delle conoscenze che può generare la combinazione della sperimentazione in microbiologia molecolare con l'associazione all'esperienza clinica e alla microbiologia clinica tradizionale.
Il miglioramento della tracciabilità dei ceppi ad alto rischio di diffusione epidemica permette l'dentificazione in tempo reale di outbreak, e la possibilità di effettuare screening di massa per il loro controllo. I risultati prodotti porteranno all'analisi di fattibilità ed efficacia della tipizzazione batterica basata su WGS nella prevenzione e controllo della diffusione ospedaliera di K. pneumoniae ed A. baumannii e all'identificazione in tempo reale dei meccanismi di resistenza agli antibiotici di maggiore rilevanza clinica. Dalla sequenza genomica possono essere dedotti l'intero contenuto di geni di resistenza anche a farmaci non testati fenotipicamente.
Il progetto si basa su una collaborazione tra la microbiologia tradizionale, la microbiologia molecolare e gli infettivologi allo scopo di proporre un modello di correzione ed ottimizzazione della terapia antimicrobica sulla base del contenuto genetico di resistenza individuato, in un'ottica multidisciplinare di antimicrobial stewardship.
La costituzione di una pipeline bioinformatica di analisi dei ceppi e comparazione dei risultati (MLST, tipo capsulare, geni di resistenza, contenuto plasmidico, isola di patogenicità, altri marcatori di interesse per la discriminazione dei tipi) ha impatto sugli aspetti fondamentali dell'innovazione scientifica, poiché le informazioni verranno utilizzate per svelare i fondamenti che governano patogenesi, virulenza, fitness, adattamento ambientale di ceppi di successo che si diffondono a livello nosocomiale e caratterizzazione della mobilità degli elementi genetici che conferiscono resistenza con la possibilità di disegnare procedure rapide di tracciamento dei cloni più rilevanti.
Inoltre, la scoperta dei meccanismi di resistenza ai nuovi farmaci di recente immissione in commercio è alla base delle indicazioni strategiche e tecniche sulla riformulazione dei trattamenti antibiotici e sui miglioramenti del loro uso clinico.