Le infezioni muscoloscheletriche sono tutt'oggi una delle principali cause di mortalità e morbidità a livello mondiale. Il loro management richiede un approccio multidisciplinare. Le tecniche di imaging medico-nucleari si sono rivelate di grande ausilio e supporto attraverso lo sviluppo di radiofarmaci mirati a discriminare un'infiammazione settica da una sterile, nonostante alcun radiofarmaco finora sviluppato si è dimostrato essere "infezione-specifico".
Scopo del presente progetto d ricerca è lo sviluppo di un nuovo radiofarmaco (99mTc-polymyxina-B) per l¿individuazione scintigrafica di batteri Gram- in modelli preclinici di infezioni muscoloscheletriche con possibilità di traslare all¿uomo tale applicazione.
La 99mTc-polymyxina-B, per la sua capacità di interagire con il lipopolisaccaride della parete dei batteri Gram-, è stata già testata in vitro, dimostrando elevata stabilità e affinità al target, mediante studi di legame in vitro. La 99mTc-polymyxina-B verrà quindi studiata in vivo per valutare la biodistribuzione in topi normali e, successivamente, in un modello animale di infezione che prevede l'inoculo dei batteri Gram+ (S. aureus), Gram- (P. aeruginosa, E. coli) e PBS come controllo negativo nell¿estremità distale del femore per mantenere localizzata l'infezione, rendendo possibile monitorare l¿andamento della malattia già nelle fasi più precoci. Ogni gruppo di studio sarà studiato a 1, 3, 6h dall'iniezione, acquisendo immagini mediante ¿-camera portatile. Al termine delle 3 e 6h, gli animali saranno sacrificati, prelevati gli organi e contati al contatore gamma a pozzetto. In parallelo, sarà effettuato un esperimento di spiazzamento per determinare la specificità del radiofarmaco, nel quale sarà aggiunta alla soluzione di radiofarmaco da iniettare un eccesso di 100 volte di molecola fredda. Al termine delle 3 e 6h, gli animali saranno sacrificati, prelevati gli organi e contati al contatore gamma a pozzetto.
Nel corso degli anni, sono stati sviluppati numerosi radiofarmaci per l'imaging delle infezioni, comprendenti principalmente peptidi antimicrobici ed antibiotici. Purtroppo, nessuno di questi radiofarmaci ha mostrato alta attività specifica, elevata specificità o sensibilità nel localizzare il locus infettivo, dipendente principalmente dalla natura del radiofarmaco, dalla sua biodistribuzione, dalle capacità di legame al target, ma anche dal tipo di micro-organismo, il tipo ed il sito di infezione e le condizioni dell'ospite. Altra complicazione non ancora risolta è il numero minimo di micro-organismi necessari affinché si ottenga un esame diagnostico valutabile e privo di bias (Auletta S et al., 2016). Tra i vari radiofarmaci, diverse classi di antibiotici sono state radiomarcate per l'individuazione dei processi infettivi grazie alla loro capacità di interferire con i normali processi metabolici dei batteri o legandosi alla membrana grazie alla presenza di cariche negative sulla stessa. La ciprofloxacina radiomarcata con 99mTc, nota anche come Infecton, è stato il primo antibiotico testato nell'uomo e, precedentemente, in diversi modelli preclinici, nonostante abbia ottenuto risultati contrastanti sia in modelli preclinici che clinici.
Per tali motivi, è strettamente necessario lo sviluppo di un nuovo radiofarmaco che abbia una maggiore specificità e selettività, in grado di discriminare la presenza di infezione batterica piuttosto che foci infiammatori.
In caso di alta probabilità di presenza di infezioni muscoloscheletriche, nella pratica clinica si utilizzano i seguenti radiofarmaci: leucociti radiomarcati (99mTc-HMPAO-WBC), anticorpi anti-granulociti tecneziati, 67Ga-citrato, 99mTc-difosfonati e 18F-FDG. La scelta di quale radiofarmaco utilizzare dipende soprattutto dal tipo di infezione e dalla fase del processo infettivo, ma la procedura di elezione è la scintigrafia con leucociti radiomarcati, che permette di valutare infezioni neutrofilo-mediate. Questa metodica permette di discriminare un¿infiammazione asettica, in cui i neutrofili sono generalmente scarsi od assenti, da un¿infiammazione settica dove la presenza di neutrofili è consistente attraverso acquisizioni a diversi time points (30 minuti, 3-4, 20-24 ore) (Jutte P et al., 2014).
Tuttavia, tutti i radiofarmaci commercialmente disponibili nella routine clinica localizzano il locus infettivo in modo del tutto indiretto, intercettando vie e cellule annesse alle infezioni e non individuando la reale causa, ovvero i batteri.
La polymyxina-B, appunto, potrebbe risultare una molecola promettente nel distinguere infiammazione sterile da infiammazione settica da batteri Gram- grazie al suo meccanismo d'azione. Infatti, la polymyxina-B è un antibiotico noto per riconoscere e legare l'LPS fino a creare dei pori sulla membrana dei batteri Gram- portandoli alla morte. In particolare, la parte polare del peptide interagisce con il lipide A dell'LPS, mentre la parte lipofilica della polymyxina-B con lo strato idrofobico della membrana esterna attraverso la destabilizzazione degli ioni Ca2+ e Mg2+ delle molecole di LPS, risultando appunto nella distruzione della membrana batterica. Pertanto, la polymyxina-B marcata con 99mTc costituirebbe un potenziale radiofarmaco per l'imaging diretto, non invasivo, specifico e selettivo delle infezioni muscoloscheletriche da batteri Gram-.
Lo sviluppo di un radiofarmaco per l'imaging delle infezioni permetterebbe al clinico di distinguere processi infettivi da infiammazione sterile, specialmente nelle protesi impiantate. Infatti, in pazienti con sospetta infezione a livello protesico, una corretta diagnosi differenziale tra infezione ed infiammazione sterile permetterebbe di intervenire in modo mirato e tempestivo, riducendo i tempi ed i costi di gestione del paziente. Sarebbe inoltre possibile monitorare la risposta alla terapia più adeguata con metodiche non invasive, evitando di sottoporre il paziente ad ulteriori prelievi e/o interventi potenzialmente non necessari.
In aggiunta ai vantaggi clinici di gestione delle patologie, tale metodica permetterebbe di ridurre il numero degli animali utilizzati in fase pre-clinica per lo studio di nuovi farmaci.
La riuscita del presente progetto e l'applicazione dell'approccio descritto comporterebbero vantaggi nel settore economico-industriale poiché favorirebbe lo sviluppo e la commercializzazione di nuovi kit diagnostici. Inoltre, la possibilità di pianificare la terapia più adeguata tramite una semplice scintigrafia abbatterebbe i costi di gestione dei pazienti, riducendo al minimo l'utilizzo di terapie che potrebbero rivelarsi poi parzialmente o totalmente inefficaci.
Auletta S et al., Clin Transl Imaging 2016
Jutte P et al., Q J Nucl Med Mol Imaging 2014