Obiettivo del progetto è lo sviluppo di un sistema Lab-on-Chip (LOC), compatto, a basso costo e a basso consumo di potenza, progettato per applicazioni nel campo della rilevazione degli agenti patogeni, quali virus, batteri o funghi, essenziale nella prevenzione della diffusione delle malattie infettive sia nell'uomo che tra animali e piante.
La tecnica base utilizzata è la Real-Time Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) in grado di eseguire l'amplificazione di molecole di RNA o DNA. Tale tecnica porta ad un raddoppio delle molecole di DNA quando la soluzione che le contiene viene sottoposta ad un ciclo termico a tre temperature (90-50-70 °C). La rivelazione Real-Time della dinamica della PCR viene implementata attraverso la lettura dei segnali di fluorescenza emessi dal DNA.
La struttura base del LoC proposto include:
- Il sistema di attuatori e sensori integrati su vetro (System on Glass: SOG) che comprende: riscaldatori a film sottile per i trattamenti termici del DNA, sensori di temperatura in silicio amorfo per il controllo termico del processo, fotosensori in silicio amorfo per la rivelazione on-chip della fluorescenza, un filtro ottico interferenziale con banda passante nelle lunghezze d'onda della fluorescenza;
- Una rete microfluidica monouso in PDMS, in cui avviene la reazione di RT-PCR;
- Una sorgente di radiazione a LED per la eccitazione delle molecole fluorescenti;
- Una scheda elettronica di controllo per acquisire i segnali dai sensori di luce e temperatura, per pilotare i riscaldatori a film sottile e le sorgenti di radiazione e per la visualizzazione real time della dinamica del processo PCR.
I partecipanti sono già stati coinvolti in attività di ricerca nell'ambito di analisi biomolecolari a hanno già collaborato con successo ad altri progetti nazionali ed europei. Questo know-how insieme con la disponibilità del laboratorio di tecnologie microelettroniche del DIET -Sapienza è un punto di partenza prezioso e importante per il successo del progetto.
Questo progetto di ricerca si inserisce nel panorama dello sviluppo di piattaforme per analisi cliniche che siano portatili, miniaturizzate e altamente automatizzate, tali da realizzare analisi di tipo point-of-care affidabili e a basso costo. Il concetto di Lab-on-Chip (LoC) è nato dalla modifica dell'approccio "total analysis system" (TAS) che, tramite la miniaturizzazione e l'integrazione di tutte le fasi dell'analisi (iniezione, reazione, separazione e rilevazione) all'interno di un singolo dispositivo, risulta essere un sistema simile a un sensore, con tempi di risposta brevi, basso consumo di campione, operabilità in campo e alta stabilità.
In particolare, lo scopo del presente progetto di ricerca è sviluppare un sistema Lab-on-Chip optoelettronico per la amplificazione molecolare di DNA tramite la tecnica "Polimerasi Chain Reaction" (PCR)
Negli ultimi anni sono stati sviluppati diversi LoC per sistemi di analisi portatili che permettono di effettuare analisi di minime quantità di campione (ad esempio sangue, saliva, urina). Un punto critico nella miniaturizzazione di tali dispositivi è costituito dalle tecniche di rivelazione, che nel maggior numero dei casi viene effettuata off-chip. con metodi meccanici, piezoelettrici, di risonanza plasmonica superficiale, di misura della capacità o di effetto di campo.
Tuttavia, per i migliori limiti di rivelabilità ottenibili, le tecniche più utilizzate si basano sulla rivelazione ottica di fenomeni di assorbimento, fluorescenza o bio-chemiluminescenza dovuti all'interazione marker specifico della malattia/siero del paziente. Anche la rivelazione ottica è usualmente ottenuta off-chip tramite CCD raffreddate.
Il progetto proposto contiene aspetti innovativi sia da un punto di vista applicativo che in ambito scientifico. In particolare dal punto di vista applicativo si propone l'integrazione sul LoC di tutti i componenti necessari alla analisi biomolecolare, compresa la rivelazione on-chip delle molecole di DNA tramite fotorivelatori basati sulla tecnologia del silicio amorfo idrogenato (a-Si:H) la cui temperatura di deposizione (al di sotto di 250°C) permette l'uso di substrati come vetro e polimeri. Inoltre, i fotosensori in a-Si:H mostrano alta efficienza nel visibile, una bassa corrente di buio, risultando pertanto candidati ideali in applicazioni di riconoscimento biomolecolare.
Gli obiettivi del progetto si avvarranno del know-how del gruppo proponente nell'ambito della rivelazione di biomolecole. In particolare, nel recente passato è stato sviluppato e brevettato dai proponenti un "Sistema integrato per analisi chimica e/o biomolecolare, e relativo procedimento di fabbricazione" che integra la separazione di biomolecole, attraverso la cromatografia a strato sottile, e la loro rivelazione quantitativa tramite fotosensori in a-Si:H.
In due precedenti progetti PRIN, stata dimostrata la rivelazione di sequenze di oligonucleotidi utilizzando sensori sensibili alla radiazione ultravioletta (UV) in a-Si:H. E' stata sviluppata con successo una tecnica label-free basata sull'effetto ipocromico con limite di rivelazione di 1 nMxcm con strand di DNA di 30-mer in soluzione. Limiti di rivelabilità nell'ordine di pochi nmol/l sono stati ottenuti nella rivelazione di DNA marcato con fluorocromi tramite fotosensori in a-Si:H sensibili alla luce visibile. Inoltre il proponente è stato Coordinatore Scientifico di due progetti di ricerca europei, presentati in ambito FP7: "OTASENS" (2009-2011), e "DEMOTOX" (2013-2015), che hanno portato alla realizzazione di un prototipo di sistema portatile per l'analisi della presenza di tossine alimentari in vino, birra e mangimi animali, e della sua ingegnerizzazione ai fini di una produzione industriale.
La valutazione finale del progetto, sempre in ambito applicativo, sarà la dimostrazione della funzionalità del prototipo del sistema lab-on-chip integrato, ed in particolare la caratterizzazione delle prestazioni analitiche (es. limite di rivelazione e quantificazione, intervallo di linearità) e la validazione delle analisi attraverso il confronto con una tecnica già validata.
L'aspetto innovativo in ambito scientifico potrà essere valutato considerando l'interesse del mondo scientifico verso la problematica considerata e quindi attraverso le pubblicazioni su riviste scientifiche e le presentazioni a congressi nazionali ed internazionali. L'impact factor delle riviste e la reputazione delle conferenze rappresentano elementi di sicuro riferimento. A questo proposito, tuttavia, è bene tenere presente che le pubblicazioni seguono (ovviamente) il lavoro con un certo ritardo, tipicamente confrontabile con la durata di questo Progetto. Un ulteriore criterio sarà la presentazione di progetti di ricerca in ambito internazionale (es. europeo) sfruttando l'esperienza acquisita per lo svolgimento delle attività previste.