La presente proposta intende essere il logico proseguimento di progetti di ricerca in precedenza finanziati da quest'Ateneo, rivolti a indagare la natura degli eventi in grado di innescare transizioni neurotossiche nel compartimento microgliale, in modelli cellulari. Questi nostri studi hanno già contribuito ad evidenziare come nella via di attivazione microgliale associata al quadro clinico del morbo di Alzheimer (AD) entrino in gioco variazioni di livelli di espressione proteica, modulazione di vie di segnalazione, e modificazioni post-traduttive.
Nell'impalcatura dell'indagine che si propone con questa presente richiesta di finanziamento, percorreremo una linea di ricerca di grande interesse attuale, rivolta a comprendere le basi molecolari delle transizioni microgliali in presenza di depositi amiloidei e infezioni fungine. Tale linea propone la tesi che la risposta neurotossica da parte della microglia, atta a scatenare la reazione infiammatoria alla base della progressione della malattia di Alzheimer, possa essere causata dalla presenza nel SNC di organismi infettivi anche in quantità subclinica. Utilizzeremo ceppi selvatici di Candida albicans e Candida glabrata per analizzare l'alterazione dello stato e della risposta microgliale in presenza ed in assenza di depositi Ab, insieme a ceppi resistenti ottenuti in coltura o da isolati clinici. Recentemente lo stesso gruppo di ricerca si è rivolto alla determinazione dei profili proteomici delle vescicole extracellulari rilasciate dalla microglia nello stato di immunosorveglianza. Nella presente richiesta ci proponiamo di ampliare la raccolta di questi dati anche allo stato microgliale pro-infiammatorio indotto specificatamente da peptidi beta amiloidi in presenza ed in assenza di agenti fungini, per identificare nella componente esosomiale eventuali messaggi molecolari selettivi responsabili dell'inasprimento dell'attività citotossica.
Lo scorso anno, il gruppo del Baylor College of Medicine guidato da David Corry ha osservato che l'infezione cerebrale da parte di C. albicans, indotta a basso grado di virulenza sperimentalmente in cervelli di topo, si accompagna alla formazione di strutture granulomatose nel tessuto cerebrale e a deficit di memoria [ref.10 del precedente paragrafo]. Un aspetto particolarmente interessante del risultato è che le placche osservate nel cervello dei topi sono assai simili alle tipiche placche che si riscontrano nel cervello dei malati di Alzheimer. Infine, gli stessi autori sono riusciti a dimostrare che i peptidi Ab endogeni che si accumulano al centro della granulosi indotta dalle cellule fungine, probabilmente rilasciati dalla proteina umana APP per azione della componente proteica presente nel secreto dell'ospite, sono in grado di esaltare l'azione funginostatica della microglia. Questi risultati quindi supportano l'ipotesi che anche in vivo la risposta neurotossica da parte della microglia alla ripetuta presenza nel SNC di organismi infettivi (per travaso dal sistema sanguigno mediante meccanismi ancora non completamente compresi) possa essere elicitata dalla presenza nel sito di infezione cerebrale di materiale amiloideo. L'amiloidosi fungo-dipendente, utile a difendere il tessuto dall'agente estraneo in caso di infezioni a bassa carica di virulenza, se cronicizzata, potrebbe pertanto rappresentare un altro meccanismo con cui la risposta di difesa tipica delle cellule microgliali viene esacerbata dalla persistenza del segnale, e si trasforma in un danno neurotossico.
I risultati presentati dal gruppo americano - che noi, grazie ai finanziamenti ricevuti lo scorso anno, abbiamo cercato di riprodurre senza successo - richiedono una più approfondita analisi in quanto non immediatamente riproducibili aprendo la strada ad una comprensione più raffinata delle caratteristiche necessarie alla Candida per effettuare quella stimolazione microgliale responsabile dell'instaurarsi dello stato patologico. L'obiettivo principale di questa fase sarà quello di evidenziare i fattori fenotipici necessari alla Candida per la sua sopravvivenza in presenza della microglia e per elicitare la transizione microgliale versi la forma infiammatoria. Grazie alla collaborazione iniziata con il gruppo di Huston, avremo a disposizione il ceppo utilizzato per lavoro su Nature Communication e quindi per poter evidenziare affinità e differenze molecolari con i ceppi in nostro possesso. Inoltre, analizzeremo lo stato della microglia in presenza delle cellule di Candida in grado di stimolare la risposta investendo le competenze multidisciplinari del nostro gruppo per verificare lo stesso pannello di biomarcatori della transizione pro-infiammatoria indotta da amiloidi da noi acquisiti in passato, in cellule attivate in presenza di una componente fungina.
Inoltre, intendiamo ampliare l'analisi del ruolo dell'infezione fungina ad altre specie del genere di Candida ed a ceppi in grado di sviluppare resistenza ai farmaci. Il razionale di questa nuova idea progettuale è che nella popolazione umana le candidosi disseminate più gravi sono di solito causate sia da ceppi resistenti di C. albicans ma anche da C. glabrata, un lievito aploide che rappresenta circa il 15% delle infezioni da Candida registrate in tutto il mondo, in particolare quelle sistemiche. Di particolare interesse è inoltre l'osservazione, riportata in diversi studi, che l'acquisizione nosocomiale di C. glabrata sia un evento molto diffuso, non collegato a immunodeficienze (come tipicamente per le candidosi di C. albicans) ma piuttosto a fattori esogeni all'organismo affetto, quali una prolungata durata del ricovero in ospedale e precedenti trattamenti antimicrobici [1].
Contiamo pertanto di confrontare i profili di cellule microgliali sottoposte a peptide Ab o a infezione controllata da parte di specie di Candida selvatici e resistenti, identificando per la prima volta i tratti morfologici, funzionali e proteomici distintivi di questa transizione ospite-dipendente. La possibile identificazione di nuove vie di segnalazione (intra- o extra-cellulari) aprirebbe la prospettiva all'utilizzazione di nuovi biomarkers selettivi nella diagnostica preventiva di malattie neurodegenerative, e finanche alla progettazione di farmaci mirati alla loro prevenzione.
1. Vitali et al 2017 Journal Chemother 29: 164