Le proteine transmembrana (TMPs) sono una tipologia di proteine che mette in comunicazione l'ambiente extracellulare e quello intracellulare con la funzione di regolare processi e trasdurre segnali per indurre una risposta da parte della cellula. L'attivazione avviene attraverso stimoli esterni (luce, differenza di pH, potenziale elettro-chimico locale) che causano un cambio strutturale e conformazionale della proteina che le permette di esplicare la sua funzione. In questa classe di proteine, rientrano le rodopsine fotoattive, ovvero TMPs la cui attività di canale ionico o pompa protonica è attivata dall'assorbimento di luce visibile. Nell'ultimo decennio ha suscitato particolare interesse lo studio della Channelrodopsina (ChR), un canale ionico che trova applicazione nel campo delle neuroscienze chiamato optogenetica, permettendo il lancio controllato di impulsi neuronali attraverso l'utilizzo di luce visibile.
La spettroscopia infrarossa (IR) ed è un valido strumento che permette di studiare i cambi conformazionali delle proteine funzionali alla loro attività. In questo contesto, il progetto si prefigge lo scopo di realizzare misure di spettroscopia infrarossa su singole membrane contenenti ChR portando le capacità della spettroscopia IR alla nanoscala. Ciò sarà possibile grazie all'utilizzo di un innovativo approccio di nano-spettroscopia infrarossa in campo vicino basata su un microscopio a forza atomica (AFM) per rivelare l'espansione termica su scala nanometrica indotta dalla radiazione emessa nel medio infrarosso da un laser a cascata quantica (QCL). Misure risolte in tempo e sotto condizioni elettrostatiche controllate permetteranno di far luce sul meccanismo di apertura del canale ionico della ChR sondando le variazioni strutturali di poche centinaia di molecole proteiche al livello della singola membrana cellulare.
La spettroscopia IR è una tecnica ampiamente utilizzata per lo studio della composizione di campioni biologici, grazie alle sue proprietà non-distruttive e label-free. Fino ad ora questo tipo di metodo è stato limitato nelle applicazioni di studio delle componenti molecolari dal fatto che non permette di sondare regioni di dimensione inferiore a quella micrometrica.
Lo sviluppo della tecnica di spettroscopia IR alla nanoscala, basata sull'utilizzo di un microscopio a forza atomica e radiazione laser IR, negli ultimi anni ha permesso di sondare composizione e proprietà di campioni biologici, polimerici o materiali nanostrutturati, fornendo un'alternativa alle tecniche di spettroscopia IR tradizionali. Questo approccio si rivela di fondamentale importanza nell'ambito delle nanoscienze della vita per lo studio di un campione di composizione eterogenea, come può essere un sistema biologico, in cui si ha la necessità di studiare un singolo costituente molecolare, isolandone il segnale di assorbimento IR rispetto alla totalità del sistema. Inoltre, la peculiarità della tecnica è anche quella di richiedere, rispetto alla tecniche tradizionali, una quantità davvero piccola di campione fino al caso più interessante, ovvero il raggiungimento della sensibilità di rivelazione IR della singola molecola biologica (proteine, acidi nucleici, lipidi) di dimensioni nanometriche e in modo non-invasivo.
Il presente progetto trarrà vantaggio dalle capacità di risoluzione nanometrica di tale strumento, sviluppando al tempo stesso metodi che permettano il controllo della cinetica dell'attività di proteine nel loro ambiente nativo, in uno stato di idratazione controllato e sotto condizioni elettromagnetiche opportune e ben note. È previsto lo studio di campioni di proteine di membrana fotoattive (ChR-2) che svolgono attività controllabili e reversibili e il cui meccanismo di funzionamento al livello molecolare può essere studiato con la spettroscopia infrarossa. I risultati ottenuti da questo tipo di campioni saranno utili per la comprensione della funzionalità delle proteine anche in vista della loro applicazione nell'ambito delle neuroscienze, in particolare nel campo dell'optogenetica.
Per quanto riguarda l'innovatività legata alla tecnica di nanospettroscopia IR laser, lo strumento basa la sua funzionalità su un laser a cascata quantica impulsato che permette di ampliare la risoluzione temporale, limitata ai microsecondi per le tecniche FTIR convenzionali, fino ai nanosecondi.
Un ulteriore sviluppo della tecnica sarà quello di applicare una differenza di potenziale fra la punta metallica del microscopio a forza atomica e il substrato metallico sul quale verranno depositati i campioni, per introdurre un campo elettrico come variabile di studio nell'investigazione della dinamica delle proteine durante la loro attività. Ciò permetterà per la prima volta di studiare le modifiche conformazionali delle proteine, sondate con la spettroscopia IR, in funzione del valore del potenziale di membrana di una cellula, che è variabile nelle cellule eccitabili come le cellule neuronali, e influisce sulla dinamica delle proteine. Nessun'altra tecnica sviluppata fino ad ora è riuscita ad ottenere informazioni sulla relazione che lega questi due aspetti.