Gli isoflavoni naturali, polifenoli presenti nelle piante della famiglia delle Fabacee, sono tra i fitoestrogeni più noti. La loro struttura chimica simile a quella del 17 beta-estradiolo consente loro di legarsi ai recettori beta degli estrogeni con effetti benefici sui disturbi della menopausa. Inoltre, studi condotti sia in vivo che in vitro hanno ampiamente dimostrato che gli isoflavoni presentano altre attività farmacologiche molto interessanti come attività antitumorale, antinfiammatorie e antivirale. Tutte queste proprietà sono riconducibili all'elevato potere antiossidante degli isoflavoni. Tuttavia, non è ancora ben noto con quale meccanismo gli isoflavoni esplicano la loro attività antiossidante.
Il progetto si propone di contribuire a individuare la relazione tra struttura chimica e l'attività antiossidante della genisteina, l'isoflavone con la più promettente bioattività, combinando insieme tecniche spettrometriche di massa e spettroscopiche. In primo luogo, vorremo caratterizzare strutturalmente la genisteina nelle sue forme protonata, deprotonata, coordinata con biometalli e come catione radicale, isolate come ioni gassosi mediante la spettrometria di massa (MS) accoppiata ad una sorgente ad electrospray (ESI) per le specie cationiche e anioniche e ad una sorgente a ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI) per quella radicalica. La spettrometria di massa è altresì interfacciata con la spettroscopia vibrazionale basata su Infrared multiple-photon dissociation (IRMPD). Si procederà a confrontare le diverse proprietà antiossidanti delle specie caratterizzate mediante misure di cinetica di reazione da effettuare allo spettrometro di massa a risonanza ionica ciclotronica a trasformata di Fourier (FT-ICR) con neutri selezionati rappresentativi dei ROS.
Nel corso del lavoro, saranno impiegate tecniche di ion mobility, Collision induced dissociation e calcoli teorici per evidenziare conformeri strutturali e interpretare gli spettri sperimentali.
L'obiettivo principale del presente progetto di ricerca è quello di ottenere informazioni sulla relazione struttura-attività antiradicalica della genisteina l'isoflavone naturale più diffuso e a maggiore attività antiossidante in natura.
Aspetto peculiare e innovativo della proposta risiede nell'ambiente prescelto per lo studio che intende operare allo stato isolato sulle forme ioniche della genisteina, ossia deprotonata, protonata, complessata con alcuni cationi metallici di importanza biologica, Cu (II) e Zn (II) in particolare e come catione radicale.
Lo studio si sviluppa sfruttando principalmente due metodologie strumentali diverse e complementari basate sulla spettrometria di massa: la spettroscopia IRMPD e le misure di costante cinetiche di reazione ione-molecola da determinare mediante l'utilizzo dello spettrometro di massa FT-ICR.
Le specie che vogliamo analizzare sono state individuate da calcoli teorici come possibili intermedi del meccanismo di reazione dell'attività antiossidante della genisteina o postulate a conclusione di studi fenomenologici ma non sono mai state caratterizzate sperimentalmente.
Le innumerevoli proprietà farmacologiche della genisteina la rendono sicuramente una molecola molto interessante ma è anche importante determinare sperimentalmente i meccanismi d'azione nel quale è coinvolta biologicamente. Tuttavia, nonostante la presenza di un numero significativo di pubblicazioni incentrate sulla attività biologica della genisteina, basate soprattutto su evidenze fenomenologiche, non ci sono studi di spettrometria di massa incentrati alla comprensione dei meccanismi molecolari che sono responsabili di tale attività poiché la maggior parte delle ricerche sulla genisteina, isoflavoni o flavonoidi in generale che impiegano metodi di spettrometria di massa sono focalizzati principalmente al determinare la loro presenza, alla loro identificazione, isolamento e quantificazione in matrici biologiche.
Il primo punto di innovazione sarà quello di ottener informazioni strutturali sulle specie ioniche della genisteina isolate e allo stato gassoso mediante l'ottenimento di spettri IR di intermedi chiave nell'attività biologica della genisteina. L'interpretazione stessa degli spettri IR non è comunque banale anche dal punto di vista computazionale, poiché sono specie che possono dare origine a vari isomeri e/o conformeri la cui co-presenza nella popolazione ionica campionata può portare ad una iniziale difficile lettura degli spettri a causa della presenza di modi vibrazionali sovrapposti.
Il secondo punto di innovazione sarà quello di evidenziare l'attività anti-radicalica delle specie studiate mediante lo studio delle cinetiche di reazione ione (già caratterizzato strutturalmente) -molecola in fase gassosa da eseguire allo spettrometro di massa FT-ICR. Uno dei vantaggi della fase gassosa consiste nel fatto che le misure avvengono in assenza di effetti dovuti alla presenza di molecole di solvente o di controioni, in modo da evidenziare la reattività intrinseca di ioni, costituendo così un valido riferimento ed una alternativa allo studio di analoghe reazioni effettuate in soluzione. I valori delle costanti cinetiche di reazione permetteranno di ottenere una scala di attività tra le varie specie studiate. A tal fine sarà molto importante anche individuare un opportuno reagente di riferimento. Inoltre, lo studio stesso delle reazioni ione-molecola condotte in fase gassosa ci potrà indicare i meccanismi di reazioni coinvolti e fornire un contributo per interpretare una correlazione struttura-attività.
L'approccio metodologico combinato che qui si propone, quantunque basato su solide competenze del gruppo proponente, ha sicuramente carattere innovativo. Verifica e confronto sui risultati raggiunti durante le varie fasi del progetto saranno perseguiti sia attraverso discussione interna al gruppo e con altri ricercatori cointeressati, sia tramite presentazione e confronto con i colleghi in convegni nazionali e internazionali
In particolare, nel corso del progetto gli obiettivi raggiunti saranno analizzati e valutati secondo i criteri seguenti:
1) Efficacia della chimica per ottenimento delle specie ioniche da studiare,
2) Confronto tra spettri IR sperimentali e quelli conseguiti con calcoli teorici per una descrizione ottimale della specie ionica in esame;
3) Individuazione dei neutri da impiegare nelle misure di reazione ione-molecola, atti a discriminare fra le diverse specie studiate.
In considerazione del tempo richiesto per la pubblicazione di un lavoro scientifico, un criterio utile di valutazione sarà costituito dalle comunicazioni presentate dai componenti del progetto a conferenze nazionali e internazionali.