Gli ormoni tiroidei sono una classe di composti biologicamente attivi prodotti dalla tiroide. La funzione di questi ormoni è di modulare il consumo energetico basale ed il metabolismo di glucidi e lipidi. Sono inoltre coinvolti nella crescita e nello sviluppo dell'organismo. Gli ormoni tiroidei principali sono la tiroxina (T4), la triiodotironina (T3) e la triiodotironina inversa (rT3). T4 ed in particolare T3 attivano il metabolismo energetico, mentre rT3 agisce come antagonista competitivo di T3. La funzione tiroidea può essere alterata generando ipotiroidismo e ipertiroidismo, stati patologici che possono risultare fortemente debilitanti. In particolare, l'ipertiroidismo è causa di palpitazioni e tachicardia che possono sfociare in un attacco cardiaco potenzialmente fatale. I livelli degli ormoni tiroidei devono quindi essere monitorati per costruire un'adeguata terapia di supporto per queste condizioni patologiche. La quantificazione dei livelli sanguigni di T4, T3 e rT3 è attualmente eseguita tramite test immunologici che non sempre mostrano la necessaria specificità e sensibilità. Per questo, metodi alternativi come la spettrometria di massa accoppiata alla cromatografia liquida (LC-MS) sono in fase di studio. Inoltre, operando in modalità ioni negativi, è possibile separare T3 e rT3 basandosi sul loro profilo di frammentazione ottenendo un'elevata specificità. Questo progetto si propone di studiare a livello molecolare le caratteristiche strutturali alla base del diverso comportamento delle forme deprotonate di T3 e rT3 quando sottoposte a dissociazione unimolecolare. Gli ormoni T4, T3 e rT3 verranno studiati tramite spettroscopia IR in fase gassosa e spettrometria di massa accoppiata alla mobilità ionica. Eventuali differenze nella loro reattività saranno valutate tramite reazioni ione-molecola eseguite nella cella di uno spettrometro FT-ICR. Calcoli DFT e post Hartree Fock verranno infine eseguiti per supportare e interpretare il dato sperimentale.
L'idea per questo progetto è stata stimolata dalla lettura di alcuni articoli scientifici che discutono il profilo di frammentazione CID di ormoni tiroidei deprotonati.[8,9,17] Quello che risulta particolarmente interessante è la notevole differenza tra i prodotti della dissociazione di [T3-H]- e [rT3-H]-.[9,17] La principale difficoltà, infatti, per l'utilizzo della spettrometria di massa come tecnica di elezione per l'analisi degli ormoni tiroidei, è la difficoltà nella separazione di T3 e rT3, specie isobare che si differenziano solo per la posizione di un atomo di iodio. Utilizzando la modalità ioni negativi, è quindi possibile progettare dei metodi analitici per la caratterizzazione simultanea di T4, T3, rT3 e T2.[8,18] Blanksby et al. hanno, in particolare, notato come la frammentazione di [T3-H]- segua dei percorsi sovrapponibili a quelli di [T2-H]-, mentre [rT3-H]- se ne differenzia.[17] L'aggiunta di un singolo atomo di iodio in posizione 3' non va quindi a modificare la reattività unimolecolare della molecola, mentre le due sostituzioni in 3' e 5', nelle due posizioni orto dell'anello fenolico, portano ad una sostanziale differenza. L'ipotesi è che l'effetto dei due atomi di iodio in posizione orto al fenolo in rT3 provochi un aumento di acidità tale da far sì che una buona percentuale di [rT3-H]- sia in forma di fenato, mentre [T3-H]- e [T2-H]- sono in forma di carbossilato. Questo è supportato anche dall'osservazione per [rT3-H]- di canali di frammentazione compatibili con la presenza dell'acido carbossilico in forma neutra.[17] Risulta quindi di grande interesse scientifico la possibilità di caratterizzare a livello molecolare i motivi strutturali e i siti di deprotonazione degli ormoni tiroidei. La spettroscopia IRMPD in associazione al calcolo computazionale promette di risolvere la struttura degli anioni in esame e dare informazioni chiare sul sito di deprotonazione permettendo quindi di razionalizzare le differenze osservate in CID. I siti di deprotonazione di aminoacidi naturali e fosforilati sono stati infatti caratterizzati con queste tecniche,[10,11,19,20] ed è stato anche dimostrato che l'utilizzo di sorgenti di ionizzazione soft, come le sorgenti elettrospray (ESI) che ci proponiamo di utilizzare, permette di ottenere ioni che conservano i siti di deprotonazione generati in soluzione.[21] Le informazioni ottenute in un ambiente controllato e privo di interferenti come la fase gassosa potranno quindi essere trasferite al comportamento nella ben più complessa fase liquida. Reazioni ione-molecola con acidi e con dietilmetossiborano[22] verranno anche sfruttate per confermare le informazioni ottenute tramite l'indagine spettroscopica. Infine IM-MS sarà associata agli esperimenti precedenti. Siti di deprotonazione differenti hanno infatti un grande impatto sulla mobilità ionica.[21] Questo ci spinge a pensare che potremmo ottenere anche una separazione degli ioni [T3-H]- e [rT3-H]- tramite IM-MS, fornendo alla comunità scientifica una nuova informazione su cui lavorare per creare nuovi processi analitici di quantificazione degli ormoni tiroidei.
[17] A.M. Couldwell, M.C. Thomas, T.W. Mitchell, A.J. Hulbert, S.J. Blanksby, Tandem mass spectrometry of deprotonated iodothyronines, Rapid Commun. Mass Spectrom. 19 (2005) 2295-2304.
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[19] J. Oomens, J.D. Steill, B. Redlich, Gas-Phase IR Spectroscopy of Deprotonated Amino Acids, J. Am. Chem. Soc. 131 (2009) 4310-4319.
[20] D. Scuderi, C.F. Correia, O.P. Balaj, G. Ohanessian, J. Lemaire, P. Maitre, Structural characterization by IRMPD spectroscopy and DFT calculations of deprotonated phosphorylated amino acids in the gas phase, ChemPhysChem. 10 (2009) 1630-1641.
[21] D. Schröder, M. Budešínský, J. Roithová, Deprotonation of p-hydroxybenzoic acid: Does electrospray ionization sample solution or gas-phase structures?, J. Am. Chem. Soc. 134 (2012) 15897-15905.
[22] H. Zhu, J.P. Max, C.L. Marcum, H. Luo, M.M. Abu-Omar, H.I. Kenttämaa, Identification of the Phenol Functionality in Deprotonated Monomeric and Dimeric Lignin Degradation Products via Tandem Mass Spectrometry Based on Ion-Molecule Reactions with Diethylmethoxyborane, J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (2016) 1813-1823.