La rivelazione di sostanze a carattere anabolizzante, come testosterone ed analoghi, è basata sull'analisi e successiva caratterizzazione del profilo steroideo urinario di ciascun atleta sottoposto a controllo anti-doping. Il profilo steroideo urinario comprende le concentrazioni ed i rapporti tra esse di una serie di sostanze endogene ad attività anabolizzante tra cui il testosterone ed il suo epimero in posizione 17, conosciuto come epitestosterone, misurate mediante gas-cromatografia accoppiata alla spettrometria di massa-massa (GC-MS/MS). La rivelazione dell'assunzione fraudolenta di testosterone è basata sulla determinazione del rapporto tra le concentrazioni urinarie di testosterone ed epitestosterone (T/E). Quando tale valore supera la soglia stabilita dall'Agenzia Mondiale Anti-Doping il campione viene sottoposto ad ulteriori analisi con lo scopo di confermare l'assunzione a fini doping della sostanza vietata. La cinetica escretiva degli ormoni androgeni anabolizzanti può essere però alterata in presenza di diverse condizioni fisiologiche e patologiche che quindi potrebbero compromettere l'applicazione del suddetto criterio. A questo proposito nel presente progetto di ricerca ci proponiamo di sviluppare e validare, secondo i criteri dettati dall'Agenzia Mondiale Anti-Doping, un metodo analitico in GC-MS/MS per la ricerca di quattordici esteri del testosterone in matrice plasma/siero dato che la presenza di essi è prova inconfutabile dell'assunzione esogena di testosterone. I risultati di tali analisi potrebbero inoltre essere utilizzati per l'implementazione del Passaporto Biologico dell'Atleta migliorando la definizione dei range di normalità caratteristici di ciascun individuo.
La necessità sempre maggiore di incrementare le performances sportive spinge, ancora oggi, un nutrito numero di atleti a fare uso di sostanze vietate dall'Agenzia Mondiale Anti-Doping e, tra quelle più abusate annoveriamo gli steroidi anabolizzanti. Nel caso in cui tali sostanze vengano somministrate in "microdosi" oppure mediante formulazioni a rilascio modificato diviene sempre più difficile la loro rivelazione ed è per questo che la ricerca in campo anti-doping è orientata sempre maggiormente verso lo sviluppo di metodologie analitiche che siano il più specifiche e selettive possibili.
In quest'ottica ci siamo proposti con questo progetto di sviluppare e validare un metodo multianalita in GC-MS/MS per la ricerca degli esteri del testosterone in matrice plasma/siero. La tecnica analitica presa in considerazione è la stessa utilizzata in routine dai Laboratori Anti-Doping accreditati per la rivelazione del doping da steroidi pseudo-endogeni su campioni urinari. Sebbene in letteratura siano riportati una serie di metodi per la ricerca degli esteri del testosterone basati sull'utilizzo della cromatografia liquida accoppiata a spettrometria di massa ci siamo proposti di lavorare in gas-cromatografia accoppiata a spettrometria di massa tandem per avere da una parte ottima riproducibilità, specificità e sensibilità degli spettri di massa dei trimetilsililderivati degli esteri del testosterone, dovuta alla frammentazione univoca di queste sostanze in seguito al transito all'interno di una sorgente ad impatto elettronico, e dall'altra la possibilità di confrontare in maniera diretta i dati ottenuti dall'analisi del profilo steroideo urinario con quelli ottenuti dalla ricerca degli esteri del testosterone. Oltre a questo una volta constato che esistono delle transizioni comuni a tutti gli esteri del testosterone si potrebbe effettuare questo tipo di analisi, ove si abbia a disposizione come matrice biologica il plasma oppure il siero, oltre che l'urina, su tutti quei campioni che hanno mostrato un profilo steroideo anomalo o sospetto, e quindi positivo all'analisi di screening, ma una analisi di conferma effettuata mediante GC-IRMS negativa.
Nel metodo analitico che ci si propone di sviluppare e validare viene contemplata anche la ricerca del 17a-OH-progesterone (17a-OH-P), precursore biosintetico del testosterone. In seguito ad assunzione fraudolenta di testosterone la concentrazione plasmatica e/o sierica di 17a-OH-P diminuisce per un effetto di feedback negativo. La misurazione del rapporto T/17a-OH-P può quindi essere utilizzata come marker indiretto dell'assunzione di altre sostanze a potere anabolizzante vietate, come ad esempio l'androstenedione.
I risultati di queste analisi andrebbero ad arricchire la collezione di informazioni relative al Passaporto Biologico dell'Atleta nel suo Modulo Endocrinologico (di futura implementazione). Obiettivo dell'Agenzia Mondiale Anti-Doping è quello infatti di tracciare il profilo endocrinologico individuale di ciascun atleta in modo tale da stabilire dei range individuali di normalità calcolati su base longitudinale e con un approccio di tipo Bayesiano.
Infine potrebbe essere proposta a livello di analisi anti-doping l'introduzione dei "Dried Blood Spot" (DBS), tecnica comunemente utilizzata in clinica per la diagnosi di patologie neonatali ed infantili. L'introduzione di questa tecnica a livello doping, nel caso in cui i risultati delle analisi siano paragonabili a quelli ottenuti utilizzando come matrice di riferimento il plasma e/o il siero, porterebbe ad un aumento della compliance dell'atleta sottoposto a controllo e una notevole diminuzione di volume di campione utilizzato (si passerebbe da 100-200 microlitri ad un massimo di 20).