La chirurgia, inserita in un approccio multidisciplinare, rappresenta ancora oggi il trattamento di elezione per i tumori solidi localizzati o metastatici (quando indicato).
Ancora oggi la localizzazione intraoperatoria è demandata all'abilità del chirurgo di localizzare visivamente o palpatoriamente le neoplasie. Questa metodica ovviamente presenta gli svantaggi dei limiti della visione umana ed inoltre la palpazione non è attuabile in chirurgia laparoscopica o robotica.
Inoltre, nonostante gli avanzamenti tecnologici nell'imaging preoperatorio, il tasso di margini chirurgici positivi non si è ridotto significativamente nelle ultime decadi.
Per migliorare la capacità del chirurgo di identificare l'anatomia di vari organi (come le vie biliari, gli ureteri, i nervi o la microperfusione) e l'esatta localizzazione di vari tumori solidi ed i loro margini, sempre più nell'ultima decade viene applicata la chirurgia guidata dalla fluorescenza (FGS). Tale metodica sfrutta la capacità di alcuni coloranti vitali di esseri riconosciuti nel campo della fluorescenza vicino all'infrarosso (NIRF) da visori dedicati.
L'equipe della prof.ssa Peneva ha sviluppato una nuova classe di molecole a base di Rodamine al Silicio pH-attivabili (pHSiRo) coniugabile con anticorpi monoclonali che risulta fluorescente solo dopo internalizzazione della molecola (tramite riconoscimento dell'anticorpo) andando a rendere visibile tramite NIRF solo il tessuto neoplastico.
Obiettivo di questo progetto è verificare l'attendibilità e specificità della captazione del pHSiRo coniugato con Bevacizumab a livello delle cellule neoplastiche colorettali e delle eventuali metastasi linfonodali.
Materiali e metodi:
Verranno arruolati 10 pazienti con tumore colorettale da sottoporre a resezioni VLS e/o open standard.
Verrà iniettato, ex-vivo, nel peduncolo vascolare del pezzo operatorio, 1mg di pHSiRo-Bevacizumab per rilevare, tramite la NIRF, la captazione sul tumore primitivo e sui linfonodi metastatici.
La FGS è un'innovativa tecnica che si basa sul riconoscimento tramite visore ottico di un segnale fluorescente proveniente da agenti di contrasto esogeni. È di notevole importanza considerare il rapporto tumor to background (TBR) dell'immagine acquisita in quanto è responsabile della detezione del confine del tessuto neoplastico da quello sano.
Per aumentare il TBR, le sostanze fluorescenti devono essere "attivabili" ovvero emettere il segnale fluorescente soltanto nel tessuto tumorale in seguito a internalizzazione cellulare. In questo modo, è possibile evidenziarne i confini ed operare la dissezione chirurgica con maggiore precisione [Kobayashi H. AccChem Res, 2011.]. Questi agenti sono in genere costituiti da una porzione molecolare fluorescente legata covalentemente ad un anticorpo monoclonale per il riconoscimento molecolare dei recettori di membrana sulle cellule tumorali.
La sostanza a base di borodipirrometene, BODIPY, sviluppata da Urano e collaboratori (sostanza fluorescente, attivabile dal pH, coniugata all'anticorpo monoclonale Trastuzumab) è un fluoroforo attivabile grazie ad un meccanismo di trasferimento elettronico fotoindotto mediato da un atomo di azoto anilinico installato sul nucleo del cromoforo . Esso spegne la fluorescenza a pH basici e, soltanto grazie all'equilibrio di protonazione di quest'ultimo, è possibile riaccendere la fluorescenza impedendo al trasferimento elettronico di avvenire. La molecola, seguendo il percorso di acidificazione nell'endocitosi mediata da recettore, è risultata attiva nella regione di tessuto tumorale, confermando la dipendenza della sua emissione fluorescente dal pH dell'endosoma-lisosoma [Urano, Y. NatMed 2009].
I fluorofori BODIPY tuttavia, emettono a lunghezze d'onda intorno ai 480nm, una regione dello spettro poco adatta alle applicazioni in vivo: è noto infatti, che sono i fotoni a bassa energia del vicino infrarosso a risultare trasparenti ai tessuti, per questo motivo, è preferibile la scelta di fluorofori che coprano questa regione con emissioni che vanno dai 650 ai 900 nanometri. [Hoogendoorn S.OrgLett 2011] [Weissleder, R. NatMed, 2003].
Sono stati inoltre testati due fluorofori a base di cianina attivi nel vicino infrarosso legati da un a struttura conformazionalmente modificabile dal cambio di pH in acqua. La nuova sostanza si attiva solo previa acidificazione nei lisosomi cellulari per interruzione del processo di trasferimento energetico di risonanza [Wang, L. Int J Cancer, 2015].
Le cianine però sono sostanze che presentano un sistema coniugato polimetinico esteso e non godono di alta fotostabilità in quanto soggette a degradazione sotto tempi di irraggiamento prolungati [Mishra, A., Chem Rev, 2000] [Gorka, A.P. Org Biomol Chem, 2015.]
Secondo Nagano e collaboratori, le rodamine al silicio, danno il segnale fluorescente secondo lo stesso meccanismo descritto nel lavoro di Y.Urano [Koide, Y. ACS Chem Biol, 2011].
La molecola fluorescente contiene infatti, una porzione anilinica in grado di spegnere la fluorescenza all'esterno della cellula e per riaccenderla all'interno una volta avvenuta l'internalizzazione nei lisosomi. Le rodamine al silicio sono note per avere un'alta resa quantica di fluorescenza e resistenza alla degradazione fotochimica, sono solubili in acqua, permeabili alle membrane cellulari e non citotossiche. Inoltre, sono di facile sintesi e la loro emissione di fluorescenza può essere spostata nell'infrarosso fino a 720 nanometri per estensione del sistema coniugato. Nagano e collaboratori hanno già testato tali sostanze in vivo dimostrandone la grande potenzialità nell'individuazione dei tumori solidi e nella trasparenza ai tessuti. [Koide, Y. ACS Chem Biol, 2011] [Grimm, J.B. ACS Cent Sci, 2017] [Grimm, J.B. Nat Methods, 2017] [Koide, Y. J Am Chem Soc, 2012]
L'equipe della prof.ssa Peneva sta sviluppando un nuovo fluoroforo a base di rodamina al silicio che non solo abbia la capacità di emettere nel vicino infrarosso, ma che sia attivabile dal cambio di pH durante l'endocitosi cellulare. Il nuovo cromoforo verrà coniugato covalentemente per questo progetto all'anticorpo monoclonale Bevacizumab per permettere l'accumulo selettivo nei tessuti tumorali conferendo la loro visualizzazione con un alto TBR. Lo sviluppo della nuova sostanza permetterà, per la prima volta, di utilizzare le potenzialità delle rodamine al silicio in FGS sfruttando lo stesso meccanismo di attivazione descritto da Y.Urano. La sintesi della sostanza si baserà sul miglioramento ed estensione delle già note metodologie descritte da L.Lavis e Nagano e porterà alla realizzazione del primo cromoforo fluorescente pH attivabile a base di rodamina al silicio coniugabile covalentemente agli anticorpi monoclonali.
I test che verranno effettuati "ex-vivo" sui tumori colo-rettali con il pHSiRo-Bevacizumab potranno definire la specificità e attendibilità di tali molecole sul cancro colo-rettale e porre le basi per ulteriori studi su diversi tipi di tumore.