La resistenza agli antibiotici, principalmente dovuta a batteri Gram-negativi multiresistenti, è un fenomeno globale che risulta aggravato da un uso inappropriato di questi farmaci. Gli antibiotici ad oggi disponibili sono inefficaci nel contrastare queste infezioni, per cui è stato necessario reintrodurre farmaci da tempo inutilizzati a causa dei loro gravi effetti collaterali, come la colistina. Tuttavia, negli ultimi anni è stata riscontrata l'insorgenza di ceppi di P. aeruginosa colistina-resistenti a causa di modificazioni attive del lipide A catalizzate dall'enzima undecaprenil fosfato transferasi alfa-4-amino-4-deossi-L-arabinosio (ArnT), che lega lo zucchero cationico 4-ammino-4-deossi-L-arabinosio (L-Ara4N) al lipide A lipopolisaccaridico. Mediante screening in silico di una libreria in house di composti naturali rispetto alla struttura cristallografica della proteina ArnT, è stata identificata la Longistilina C, uno stilbene naturale presente nelle radici e nella corteccia della pianta Lonchocarpus longistylus, come potenziale inibitore della resistenza mediata da ArnT. La capacità di questo composto di potenziare l'attività della colistina è stata dimostrata su ceppi di P. aeruginosa colistina-resistenti, senza effetti rilevanti sui ceppi sensibili. Tali risultati sono attualmente coperti da brevetto. Tuttavia, la difficile reperibilità della pianta e la scarsa efficienza della procedura estrattiva, che permette di isolare il composto in minima quantità, non hanno permesso lo svolgimento degli studi preclinici. L'obiettivo di questo progetto prevede la messa a punto di una strategia sintetica, che permetta di ottenere la molecola su larga scala, in modo da poterne completare la caratterizzazione biologica in vitro e in vivo. Inoltre, una piccola libreria di derivati sarà disegnata e sintetizzata con lo scopo di investigare la versatilità dello scaffold stilbenico e di condurre uno studio di relazione struttura-attività (SAR).
La resistenza alla colistina si sviluppa attraverso l'attivazione di sistemi di modificazione del bersaglio della colistina stessa, ovvero il lipide A che, opportunamente modificato, risulta così incapace di interagire con la colistina. I meccanismi responsabili di queste modificazioni includono l'aggiunta di 4-ammino-4-deossi-L-arabinosio (Ara4N) al lipide A, riducendo così la carica negativa netta dell'LPS e, rendendo il batterio insensibile alla colistina stessa. [Clin. Microbiol. Rev., 2017, 30, 557-596] Questa modificazione avviene attraverso una complessa serie di reazioni il cui ultimo passaggio è catalizzato dall'enzima ArnT, una Ara4N transferasi localizzata sulla membrana citoplasmatica [Science 2016, 351, 608-12]. Recentemente, la struttura cristallina di ArnT è stata risolta e sono stati chiariti i dettagli atomici della sua tasca di legame per il Ara4N, rendendo ArnT un target molto promettente per lo sviluppo di inibitori della resistenza alla colistina [Science 2016, 351, 608-12].Tenendo in considerazione queste premesse, è quindi sentita la necessità di soluzioni terapeutiche innovative in grado di aumentare l'efficacia e la durata clinica della colistina, prevenendo lo sviluppo di resistenza a tale antibiotico, o di ripristinare la sensibilità alla colistina in ceppi già resistenti. In questo contesto le sostanze naturali costituiscono un'importante risorsa di lead compounds nel drug discovery nei confronti di numerosi target biologici. I composti naturali sono infatti caratterizzati da una elevata varieta' strutturale e, avendo subito una evoluzione naturale sotto pressione selettiva, possono essere definiti a priori "biologicamente attivi". Numerose sostanze isolate da piante impiegate nelle medicine tradizionali hanno rappresentato validi modelli molecolari per lo sviluppo di nuovi farmaci o sono diventate molecole di partenza per la semisintesi di principi attivi farmaceutici. A tale proposito, una libreria disponibile in house, costituita da oltre 1000 composti di origine naturale estratti, purificati e caratterizzati, a cui si aggiungono ulteriori derivati sintetici, è stata impiegata per l'identificazione di nuovi potenziali agenti in grado di potenziare l'efficacia della colistina nel trattamento di infezioni batteriche da batteri Gram-negativi colistina-resistenti. I composti della libreria sono stati isolati da piante della medicina tradizionale, in particolare piante brasiliane, nel corso di molti anni di ricerca e appartengono a diverse classi chimiche, tra cui flavonoidi, terpeni, alcaloidi, ferruginine, calconi, benzofenoni, xantoni, antrachinoni, steroidi e altre. La peculiarità di questa libreria è dovuta all'elevata diversità chimica dei composti presenti e all'esclusività di molti di questi, rendendola una risorsa unica per l'identificazione di nuovi composti biologicamente attivi. In particolare, avendo a disposizione la libreria in formato virtuale, l'impiego della modellistica molecolare ne permette un primo screening, che consente di ridurre i tempi e i costi di analisi e permette di mettere a punto terapie selettive di tipo targeted. Secondo l'approccio structure-based drug design, avendo a disposizione la struttura cristallografica della proteina ArnT ad una buona risoluzione, la libreria è stata inizialmente sottoposta a screening in silico rispetto l'enzima ArnT in complesso con il ligando undecaprenil fosfato e, soltanto successivamente, i composti selezionati dall'analisi computazionale sono stati saggiati in vitro. I metodi computazionali, infatti, forniscono risultati teorici molto attendibili con un costo temporale ed economico notevolmente ridotto rispetto ai metodi sperimentali. Identificato, dunque, il composto hit nello screening iniziale, l'obiettivo di questo progetto prevede la messa a punto di una strategia sintetica, che permetta di ottenere la molecola su larga scala, in modo da poterne completare la caratterizzazione biologica in vitro e in vivo. Inoltre, una piccola libreria di derivati sarà disegnata e sintetizzata con lo scopo di investigare la versatilità dello scaffold stilbenico e di condurre uno studio di relazione struttura-attività (SAR).