Il pesce zebra (PZ, Danio rerio) è un piccolo ciprinide d'acqua dolce sempre più utilizzato in numerosi ambiti della ricerca scientifica. Esso è uno dei modelli di punta per l'analisi del sistema visivo dei vertebrati ed è un ottimo modello di studio traslazionale verso l'uomo. Per lo studio del sistema visivo del PZ sono disponibili vari approcci metodologici: genetici, di biologia molecolare, proteomici, immunoistochimici e comportamentali.
Il BDNF è un'importante neurotrofina che nell'occhio esercita un ruolo neuro-protettivo nei confronti delle cellule gangliari della retina ed è essenziale per il loro corretto sviluppo e mantenimento. Il BDNF non solo promuove la sopravvivenza delle cellule gangliari ma gioca un ruolo importante nel preservare l'integrità strutturale e la risposta visiva di questi neuroni.
Il presente progetto si propone di utilizzare una linea knock-out BDNF -/- (KO) di PZ per indagare il ruolo del BDNF nello sviluppo e nella funzionalità dell'occhio. I PZ KO costituiscono un ottimo modello per lo studio del BDNF nell'occhio della larva e dell'adulto essendo vitali fino alla fase adulta, a differenza dei KO di topo che muoiono durante lo sviluppo postnatale precoce.
Lo scopo principale del progetto è quello di effettuare uno studio comparativo tra l'occhio dei WT e dei KO per verificare se la mancata espressione di BDNF influenza il suo sviluppo e la capacità visiva. Si adotterà un approccio multidisciplinare comprendente la comparazione dell'intero proteoma dell'occhio di individui WT e KO sia in larve che in adulti. Le alterazioni di espressione proteica più significative verranno validate mediante l'analisi dell'espressione dei geni relativi tramite Real-time PCR. L'anatomia microscopica dell'occhio di WT e KO verrà indagata mediante analisi istologiche e immunoistochimiche. Infine, verranno effettuati test comportamentali già validati nel PZ per valutare la funzione visiva nelle larve dei soggetti WT e KO.
Background del progetto sono le competenze sviluppate, le informazioni ottenute e il network di collaborazioni consolidato nell'ambito dei progetti di Ateneo e FIRB 2012 in cui il gruppo di ricerca ha condotto studi comportamentali, proteomici e di biologia molecolare utilizzando il PZ come modello di studio. Nell'ambito del progetto FIRB è stata generata una linea mutante di PZ KO BDNF -/- che verrà impiegata in questo progetto che risulta essere innovativo per il modello utilizzato e per l'approccio multidisciplinare proposto.
Per quanto riguarda il modello scelto, a nostra conoscenza non esistono studi in letteratura relativi a PZ KO BDNF -/-. Poiché, come spiegato sopra, il PZ è un buon modello per lo studio dell'occhio e i PZ KO risultano essere vitali anche nello stadio adulto, questo studio permetterà per la prima volta di analizzare l'effetto della mancata espressione di BDNF sia nell'occhio della larva che in quello dell'individuo adulto.
L'approccio multidisciplinare comprende la comparazione dell'intero proteoma dell'occhio di individui KO e WT sia in larve che in adulti. I risultati proteomici più significativi verranno validati e ulteriormente indagati mediante l'analisi dell'espressione dei geni relativi tramite Real-time PCR. La ripercussione della mancata espressione di BDNF sull'anatomia microscopica dell'occhio verrà indagata comparando i risultati di studi istologici e di immunoistochimica condotti su KO rispetto ai WT. Infine, verranno condotti test comportamentali già validati nel pesce zebra per valutare la funzione visiva nelle larve e negli adulti WT e KO.
Risultati attesi e avanzamento delle conoscenze previsto
1) Dalle analisi proteomiche e di Real-time PCR si attendono variazioni dell'espressione di specifici geni e proteine nei soggetti KO imputabili ad un'alterata regolazione dovuta alla mancanza di BDNF.
2) Dalle analisi istologiche e immunoistochimiche si attendono variazioni dello spessore degli strati retinici e della densità cellulare di specifici neuroni. In modo particolare si attendono variazioni a carico delle cellule gangliari poiché dati di letteratura evidenziano un ruolo importante del BDNF nella loro sopravvivenza.
3) Dai test comportamentali si attendono differenze nei KO rispetto ai WT che possano indicare alterazioni nel processo di visione dovute alla mancanza di BDNF.
Il progetto fornirà quindi nuove informazioni circa il ruolo del BDNF nello sviluppo e nella funzione dell'occhio nel PZ. Poiché, come riportato sopra, la retina del PZ condivide numerose somiglianze con quella dell'uomo, i risultati ottenuti potranno fornire informazioni utili alla comprensione del ruolo di questa neurotrofina anche nell'occhio umano contribuendo ad un avanzamento nella conoscenza dei meccanismi di insorgenza di patologie oculari e nel loro trattamento.