La colangite biliare primitiva (PBC) è una malattia che colpisce le cellule epiteliali delle vie biliari (colangiociti), negli stadi iniziali è caratterizzata da infiammazione, fibrosi epatica e proliferazione delle cellule biliari. La Secretina (Sct), espressa dai colangiociti, tramite il suo recettore (SR) determina la proliferazione cellulare, la fibrosi epatica e la secrezione di bicarbonato. Lo scopo è valutare il ruolo del trattamento antagonista SR per PBC allo stadio iniziale. Topi maschi e femmine dnTGF¿RII (dominant-negative transforming growth factor-beta receptor II) e topi wild-type di 12 settimane di vita sono stati trattati con soluzione fisiologica o antagonista SR, Sec 5-27, per 1 settimana. Principali risultati attesi: i topi dnTGF¿RII che mimano le caratteristiche istopatologiche dello stadio iniziale di PBC, potrebbero mostrare modificazioni della secrezione di Sct e di bicarbonato mediata (AE 2), della proliferazione colangiocitaria, dell¿infiammazione epatica e della fibrosi epatica. Nei topi dnTGF¿RII si potrà valutare a livello colangiocitario l'attivazione di TGF-¿1 / TGF-¿R2, miR-125b / VEGFA e let7 / NGF. Si potrà anche verificare se i topi dnTGF-¿RII trattati con il Sec 5-27 possano beneficiare di un miglioramento di tutti questi parametri. Nell¿uomo, in pazienti con PBC allo stadio iniziale si valuterà l'espressione di Sct, SR, CFTR e AE2, livelli di sct sierici, l¿attivazione del meccanismo di segnaling per verificare l¿eventuale miglioramento del danno biliare ed epatico durante la fase iniziale della PBC.
Lo studio verterà sull'espressione della secretina e del suo recettore nell'albero biliare di topi Topi femmine e maschi dnTGF-¿ RII trattati con soluzione salina o antagonista SR, Sec 5-27 per 1 settimana mediante minipump IP. Ancor prima si procedera con il trattamento in vivo con Sec 5-27 dei topi BDL e Mdr2 - / -. Per gli studi saranno utilizzati i seguenti animali: n = 10 topi WT femmina (20,74 ± 0,1,3 gm); n = 10 femmine dnTGF-¿RII topi (18.50 ± 0.76 gm); n = 6 femmine dnTGF-¿RII topi + sec 5-27 (21,92 ± 0,56 gm); n = 10 topi WT maschi (24,51 ± 1,32 g); n = 10 topi maschi dnTGF-¿RII (22,79 ± 0,64 g); e n = 10 maschi dnTGF-¿RII topi + Sec 5-27 (24,67 ± 0,47). Campioni e blocchi di tessuto epatico (fissazione formalina, inclusione in paraffina o in OCT), siero, bile, colangiociti e surnatanti di colangiociti (dopo incubazione a 37 ° C per 4 ore) (25) saranno raccolti. Campioni umani: Siero umano, bile e prelievi bioptici di fegato da pazienti con diagnosi di PBC in stadio iniziale. Campioni di controllo saranno ottenuti da biopsie epatiche di pazienti senza patologie degenerative. Saranno inoltre studiati i Colangiociti isolati ottenuti mediante separazione per immunoaffinità utilizzando l'anticorpo monoclonale IgG2a contro un antigene non identificato espresso da tutti i colangiociti di topo. Dopo l'isolamento dei colangiociti, i surnatanti saranno raccolti.
L'espressione di Sct, SR, CFTR e AE2 verrà valutata mediante: (i) immunoistochimica in sezioni di fegato incluse in paraffina; (ii) qPCR da colangiociti isolati e (iii) western blot dal lisato da colangiociti isolati. Nei campioni umani, l'espressione di Sct, SR, CFTR e AE2 sarà valutata imediante RNA epatico per qPCR e in sezioni di fegato mediante iIHC. L'analisi semiquantitativa verrà eseguita utilizzando sistemi di classificazione di routine.I livelli di Sct nel siero e nella bile dei topi e nei livelli sierici dei pazienti saranno misurati mediante kit Secretin EIA.
Sarà effettuata la valutazione della morfologia del fegato, per determinare il grado di danno lobulare, la necrosi epatica e l'infiammazione portale. Misurazione dei livelli sierici di ALP in campioni di topo utilizzando i vetrini IDEXX Catalyst One (IDEXX, Westbrook, ME). Determinazione della reazione duttulare nello stadio precoce di PBC; nei campioni di topo valutazione della proliferazione dei colangiociti e la IBDM su sezioni di fegato. Vaultazione morfometrica semi-quantitativa dell¿espressione immunoistochimica per citocheratina-19 (CK-19,) e Ki-67. Misurazione della senescenza dei colangiociti nei pazienti con PBC, la senescenza cellulare nei nostri modelli murini: (i) misurando l'attività enzimatica della galattosidasi beta-SA-ß-galattosidasi associata all'uso della senescenza ¿-Galattosidasi Kit (immunoistochimica per p16 su sezioni di fegato incluse in paraffina; e (iii) immunofluorescenza per CCL2 su sezioni di fegato criostatate incluse in OCT. Valutazione della distribuzione delle cellule di Kupffer nei nostri modelli di topo e in campioni umani colorando F4 / 80 (un marcatore di cellule di Kupffer)); M1 e M2 mediante immunoistochimica per Ly6c (alta espressione in M1 e bassa espressione in M2) in sezioni di fegato ed espressione di IL-12 (M1) e IL-13 (M2) nel fegato totale mediante immunoblots.. Nei nostri modelli murini, la fibrosi epatica sarà valutata mediante (i) colorazione Sirius Red e morfometria su sezioni di fegato fissate in formalina e incluse in paraffina; (ii) qPCR per COLA1; e (iii) contenuto di idrossiprolina nel fegato utilizzando il kit di Hydroxyproline di Sigma-Aldrich, Co (St. Louis, MO). Le HSC sono i fattori chiave per la fibrosi epatica, pertanto, andremo a determinare il numero di cellule attivate in sezioni del fegato mediante (i) immunofluorescenza per synaptophysin-9 (SYP -9, un marker di HSCs attivate) co-localizzato con CK-19 per visualizzare i dotti biliari intraepatici; e (ii) immunofluorescenza per actina del muscolo liscio alfa (¿-SMA) in sezioni di fegato incluse in OCT con CK-19. Verrà inoltre valutata l'espressione dell'asse Sct-dipendente miR-125b / TGF-¿1 / R1 / VEGFA poiché abbiamo precedentemente dimostrato che Sct determina aumento: (i) proliferazione e IBDM mediante downregulation di miR-125b che provoca sovraregolazione del signaling di TGF-¿1 / R1 e VEGFA; e (ii) fibrosi epatica mediante un meccanismo paracrino mediato dall'espressione / secrezione di TGF-¿1 colangiocitaria. Nei nostri modelli animali e campioni umani analizzeremo l'espressione di TGF-¿1 / R1 e VEGFA di qPCR in campioni di fegato e in colangiociti isolati con immunofluorescenza e / o immunoistochimica; e analisi morfometrica semiquantitativa. I dati verranno espressi come media ¿ SEM. Le differenze tra i gruppi saranno analizzate dal test t di Student e mediante ANOVA.