Obiettivo del progetto è chiarire l'effetto di ioni alogenuro X- (X=Cl, Br, I) sui meccanismi di riconoscimento di aminoacidi aromatici, quali tirosina (Tir) e 3-nitrotirosina (nitroTir), in complessi non covalenti generati in soluzione e caratterizzati allo stato isolato. Le interazioni anione-amino acido comprendono aspetti rilevanti quali il signaling neuronale, il trasporto di ioni, la struttura e la solubilità delle proteine. L'effetto stabilizzante dell'anione nel complesso con la tirosina può dipendere da interazioni di legame idrogeno, ione-dipolo ed effetti idrofobici mediante il coinvolgimento dei gruppi aminico e carbossilico e dell'OH fenolico. L'aumento di acidità pi-greco per nitrazione del residuo fenolico, una frequente modifica post-trascrizionale, può inoltre favorire contatti anione pi-greco nella nitroTir. La dipendenza della stabilità relativa di forme canoniche (senza separazione di carica) e zwitterioniche dell'aminoacido dalle dimensioni di X- verrà messo a confronto con l'effetto, più estesamente studiato, prodotto da ioni metallici ed acqua. Questo studio si avvarrà di: i) tecniche avanzate di spettrometria di massa (MS) ad alta risoluzione e sorgente di ionizzazione electrospray (ESI) per identificare gli intermedi anionici [(nitro)Tir+X]- e di dissociazione indotta da collisione (CID) per rivelare frammentazioni specifiche; ii) spettroscopia vibrazionale basata sull'assorbimento multiplo di fotoni IR (IRMPD) per l'analisi strutturale degli ioni di interesse; iii) calcoli teorici per descrivere le proprietà geometriche ed energetiche della popolazione ionica ed interpretare le bande di assorbimento IR. Un'integrazione del progetto riguarda lo sviluppo di un efficiente metodo di ionizzazione ESI-MS per rivelare composti glicosilati (Gly) come addotti [Gly+Cl]- per aggiunta di ioni cloruro quali dopanti idrofili. La finalità concerne la determinazione di mono e polisaccaridi in matrici biologiche e alimentari.
A differenza delle interazioni catione pi-greco, ampiamente studiate e documentate nelle strutture di proteine e di loro addotti con farmaci e DNA, le interazioni anione pi-greco e più in generale le forze non-covalenti in complessi anionici sono state meno investigate e di recente sono divenute oggetto di un interesse crescente.[1-2] In questo progetto ci proponiamo di caratterizzare per la prima volta le forze non-covalenti che operano all'interno di complessi anionici alogenuro-tirosina e del suo derivato modificato per nitrazione aromatica, 3-nitrotirosina. La 3-nitro-tirosina offre diversi siti di legame ed il contatto anione pi-greco potrebbe dare un contributo di stabilità determinante nel caso dell'anello depauperato di elettroni della 3-nitrotirosina. L'elevata sensibilità, potere risolutivo e specificità dell'approccio metodologico adottato in questo studio rappresenta lo stato dell'arte adeguato alla caratterizzazione della struttura, stabilità e reattività di complessi alogenuro-aminoacido aromatico. In particolare, la spettroscopia IRMPD nelle due regioni spettrali di "fingerprint" (800-2000 cm-1) e di stretching X-H (X = C, N, O) (2800-3800 cm-1) , supportata dai risultati dei calcoli teorici, potrà permettere l'individuazione di bande caratteristiche di una determinata interazione non-covalente. Studi recenti hanno dimostrato le potenzialità del metodo per la caratterizzare le proprietà chimico-fisiche di complessi di alogenuri e fenilalanina.[3]
Le evidenze raccolte potranno essere messe a frutto per lo sviluppo di un metodo atto ad ottimizzare la ionizzazione ESI e la rivelazione MS di zuccheri (mono e polisaccaridi e metaboliti glicoconiugati) presenti anche in matrici complesse quali gli alimenti. L'aggiunta di una soluzione acquosa di NH4Cl, un dopante idrofilo e green, dovrebbe potenziare ampiamente la rivelabilità di tali analiti mediante la formazione di addotti non-covalenti [[Gly+Cl]- la cui stabilità relativa potrà essere valutata mediante esperimenti di CID ad energia variabile. L'analisi di matrici alimentari zuccherine derivanti da frutta e vegetali potrà essere effettuata per infusione ESI diretta di estratti acquosi in miscela con soluzione di NH4Cl a concentrazione millimolare, senza la necessità di ricorrere a laboriose preparazioni del campioni o lunghe corse cromatografiche preliminari. Verrà investigata anche la modalità di interazione dell'anione cloruro con zuccheri di complessità diversa ed eventuali metaboliti glicoconiugati.
[1] P. M. Deyà et al, Angew.Chem. Int. Ed. 2002, 41, 3389. [2] P. A. Gale et al, Chem. Soc. Rev 2009, 38, 520. [3] T. McMahon et al, PhysChemChemPhys 2014, 16, 24223.