Da quando è stata ipotizzata per la prima volta dal chimico tedesco Emil Fisher, la total synthesis di peptidi e proteine ha suscitato un sempre maggiore interesse. Tanto che, negli ultimi anni, è diventata una procedura sempre più utilizzata dall¿industria biofarmaceutica, anche grazie ai recenti sviluppi della solid phase peptide synthesis (SPPS), inizialmente sviluppata da Merrifield. Il problema principale della SPPS, che non si osserva in altri metodi di produzione, come i metodi biotecnologici del DNA ricombinante, è la formazione di impurezze diastereoisomeriche. Tali impurezze possono formarsi a causa della bassa purezza enantiomerica degli aminoacidi utilizzati come sintoni chirali, o per la naturale tendenza di alcuni aminoacidi a racemizzare, anche se già inseriti nella struttura peptidica. Il problema delle impurezze diastereoisomeriche non è da sottovalutare, il monitoraggio della stereochimica dei reagenti amminoacidici e dei peptidi è, quindi, un punto essenziale nel corso della sintesi del peptide, per assicurare la piena integrità strutturale del prodotto finito e il suo utilizzo in terapia. Tale controllo può essere effettuato solamente attraverso la separazione cromatografica, le impurezze diastereoisomeriche e il prodotto peptidico di interesse sono isobari, quindi non discriminabili attraverso l¿utilizzo di tecniche solitamente selettive come la spettrometria di massa. In questo lavoro vogliamo proporre metodi analitici che permettano di controllare l¿intero work-flow sintetico: dalla purezza enantiomerica dei reagenti chirali, all¿analisi del prodotto finito, in modo da controllare la formazione delle impurezze diastereoisomeriche. In entrambi casi si esalterà la velocità delle analisi cromatografiche, sviluppando metodologie cromatografiche innovative per rispondere alle maggiori criticità che si possono incontrare.
I contributi innovativi della ricerca sono:
i. L¿approccio utilizzato per lo studio delle impurezze diastereoisomeriche, che possono formarsi durante la sintesi dei peptidi terapeutici, segue l¿intero work-flow sintetico: dal controllo della purezza enantiomerica dei reagenti chirali, all¿analisi del prodotto finito. In entrambi casi si esalta la velocità delle analisi cromatografiche. Infatti, il tempo di analisi ridotto di una separazione cromatografica diventa imperativo in quelle aree di lavoro che richiedono un monitoraggio continuo o un adattamento in tempo reale ai cambiamenti di processo a livello industriale.
ii. Per la risoluzione cromatografica dei racemati di aminoacidi proteinogenici protetti, verrà sviluppato ad hoc un protocollo per separazioni ultraveloci. Ma soprattutto, per la prima volta si valuterà l'uso di particelle di silice totalmente porose e superficialmente porose con diversa dimensione dei pori (90Å, 120 Å e 160 Å) nel campo dell¿UHPLC enantioselettivo.
iii. Per quanto riguarda l¿analisi delle impurezze diastereoisomeriche nel prodotto finito, la strategia cromatografica qui proposta, può essere definita "dinamic" electrostatic repulsion reversed phase d-ERRP in analogia con il termine coniato nel 2014 da Gritti e Guiochon (la combinazione di interazioni intermolecolari è la stessa) [1]. Però mentre nel loro caso le cariche positive sono dovute alla presenza di gruppi amminici legati chimicamente alla superficie della silice C18 (è quindi chiara la necessità di comprare una colonna specificatamente modificata), la nostra strategia prevede la generazione online delle cariche positive grazie alla presenza dell¿agente di coppia ionica carico positivamente in fase mobile. Il metodo d-ERRP è quindi di applicabilità generale; infatti, può essere utilizzato con tutte le colonne RP a base di silice, per l'analisi di composti basici come proteine, peptidi e piccole molecole.
[1] F. Gritti et al. J. Chromatogr. A 1374(2014) 112¿121.