- L’apparecchiatura risulta attualmente l’unica in grado di processare un’elevata quantità di campioni, paragonabile a quella di una tradizionale realtime PCR. Questo sistema è l’unico che permette di lavorare in formato piastra da 96 pozzetti. La preparazione della piastra viene inoltre effettuata con modalità comparabili a quelle di un real-time PCR, rendendo immediata la transizione tra queste tecnologie. La PCR può essere eseguita su un normale termociclatore, consentendo quindi di incrementare ulteriormente la produttività del sistema. Il formato piastra da 96 pozzetti permette sia di lavorare su un numero elevato di campioni in una stessa corsa sia di analizzare target multipli per lo stesso campione; tale caratteristica riduce i costi di esercizio rispetto ad altri strumenti che permettono invece la lettura di un singolo campione alla volta
- I sistemi di generazione e lettura delle partizioni sono autonomi ed indipendenti. Tale caratteristica consente di separare senza rischi di contaminazione la fase prePCR di preparazione dei campioni, dalla fase PCR e post PCR che possono essere condotte in luoghi e tempi separati (1).
- La preparazione del campione viene eseguita mediante un sistema automatizzato. Il sistema di preparazione delle droplet è operatore indipendente e garantisce riproducibilità nella preparazione dei campioni (2).
- La lettura viene effettuata in maniera automatizzata. Ciò consente di ridurre il tempo di lavoro manuale ed elimina qualsivoglia effetto operatore dipendente.
- Il software di analisi è di libera installazione e consente la massima flessibilità tra tutti i laboratori, quindi gli utilizzatori non devono necessariamente accedere ad una singola postazione per l’analisi dei dati.
- Lo strumento consente inoltre di analizzare target diversi in PCR multiplex, questo garantisce la riduzione dei costi e permette di ridurre fortemente la variabilità legata alla tecnica di amplificazione
- Possibilità di upgrading dello strumento con un sistema automatico per la preparazione di 96 campioni in 40 minuti senza intervento dell’operatore
- Possibilità di utilizzare il modulo generator ddseq per l’analisi single cell in NGS
Lo strumento inoltre apre nuove possibilità di tipo analitico nello studio dei campioni.
La tecnologia consente una quantificazione assoluta di qualsivoglia acido nucleico, eliminando problemi di riproducibilità ed efficienza legati all’utilizzo di standard quantitativi esterni. Consente inoltre una riduzione dei costi di analisi poiché non necessita di curve di calibrazione o curve standard
Tale tecnologia è inoltre una evoluzione positiva per lo studio di mutazioni, in particolare per lo studio di mutazioni somatiche in campo oncologico. Consente infatti di analizzare in un singolo pozzetto mutazioni con prealenza fino o inferiore a 0,1%.
Tale tecnologia si avvale di kits/sonde/primers comunemente presenti sul mercato e compatibili, da utilizzare sia in ambiente clinico che di ricerca
Lo strumento è inoltre utilizzabile per applicazioni di quantificazione assoluta e relativa, quali la quantificazione dell’espressione genica e l’analisi del numero di copie genomiche (CNV):
- la quantificazione dell’espressione genica può essere effettuata sia con sonde fluorogeniche (TaqMan e simili) sia mediante fluorofori leganti (SybrGreen o simili), indifferentemente su geni o miRNA. La quantificazione assoluta, data la sua peculiarità, può essere applicata anche a campioni variabili e complessi quali RNA da tessuti paraffinati e da liquidi biologici (plasma, siero etc).
- L’analisi delle aneuploidie (variazioni del numero di copie genomiche) consente di eliminare alcune limitazioni tipiche della realtime PCR, quali l’impossibilità di discriminare tra 4 o 5 copie genomiche o numeri più elevati, superabili solamente con grandi e costose quantità di replicati. La digital PCR inoltre consente la valutazione dell’amplificazione di tratti genomici e di identificare se la medesima sia avvenuta in tandem o su loci indipendenti e non correlati (3; 4).
BIBLIOGRAFIA
- Patent IT ddPCR-Methods and compositions for nucleic acid analysis
- Patent US ddPCR-Assays with droplets transformed into capsules
- Patent US ddPCR-Methods and compositions for detecting genetic material
- Patent US ddPCR-Analysis of nucleic acids