Illumina MiniSeq utilizza la chimica di sequenziamento mediante sintesi (SBS), un metodo proprietario basato su terminatori reversibili che consente il sequenziamento massivo in parallelo di miliardi di frammenti di DNA. Le singole basi sono legate a coloranti fluorescenti che vengono acquisiti via via che ogni dNTP viene aggiunto e poi scisso per consentire l'incorporazione della base successiva riducendo al minimo le distorsioni dovute all'incorporazione. Durante ogni ciclo l'identificazione delle basi viene misurata direttamente dall'intensità del segnale, riducendo significativamente le percentuali di errore dei dati rispetto ad altre tecnologie. Il risultato finale è un sequenziamento accurato, con una percentuale di errori di chiamata di una base (Q score = QS = 10logPE probabilità di errore, cioè probabilità di chiamata di una base non corretta) più bassa rispetto ad altre piattaforme NGS. Loman et al. [21] paragonando tre sequenziatori di nuova generazione da banco: MiSeq (Illumina), 454 Junior (Roche) e IonTorrentPGM (Life Technologies) riportano un più basso tasso di errore per la piattaforma con tecnologia Illumina. Il sistema MiniSeq può arrivare ad una resa di 8 Gb in un unica corsa, per un numero massimo di read pari a 25 milioni. La lunghezza massima della read è 2 x 150 bp. L'accuratezza delle letture è garantita da un punteggio qualitativo superiore a Q30 con tasso di errore dello 0.001% nell'80% delle basi analizzate, identificando un numero più elevato di varianti vere e riducendo al minimo le chiamate false positive e false negative. La metodica SBS consente di sequenziare da entrambe le estremità, (paired-end sequencing). Poiché la distanza tra ogni coppia di lettura è nota, il sequenziamento paired-end migliora l'allineamento e l'assemblaggio del genoma. Le sequenze allineate come coppie di lettura consentono il rilevamento accurato di varianti strutturali, fusioni di geni e isoforme del trascritto.
Flusso di lavoro Il sistema MiniSeq fa parte di un flusso di lavoro ottimizzato in 4 fasi che comprende: preparazione della libreria, generazione dei cluster, sequenziamento e analisi dei dati. Preparazione delle librerie Il sistema MIniSeq è compatibile con tutta la serie dei kit di preparazione delle librerie in multiplex. Tale compatibilità incrociata consente ai ricercatori di confrontare facilmente i dati dei diversi sistemi o di passare a sistemi più grandi quali MiSeqTMo NextSeqTM. Il sistema MiniSeq può sfruttare entrambe le tecnologie di ri-sequenziamento di regioni bersaglio, mediante amplificazione con primer specifici (sequenziamento di ampliconi) o mediante sistemi a cattura con sonde selettive (arricchimento dei target). Quest'ultimo approccio consente di rilevare in maniera sistematica le varianti rare germinali e somatiche, i polimorfismi a singolo nucleotide (SNP), le varianti strutturali e le variazioni del numero di copia, garantendo la totale copertura del sequenziamento delle regioni esoniche con una migliore uniformità di copertura. I Kit disponibili consentono inoltre la preparazione di librerie per il sequenziamento di piccoli genomi Sequenziamento su sistema MiniSeq Le librerie preparate vengono caricate in una cartuccia di reagenti pronta all'uso. Il sistema MiniSeq integra in un unico strumento le fasi di denaturazione delle librerie, l'amplificazione clonale, il sequenziamento e l'analisi dei dati, eliminando così la necessità di 6 / 22 acquistare apparecchiature accessorie. L'interfaccia è intuitiva con istruzioni per ogni fase dell'impostazione della corsa e dei processi di avvio. Sostanzialmente durante il sequenziamento singole molecole di DNA si legano sulla superficie della cella a flusso e in seguito vengono sottoposte ad amplificazione clonale formando i cluster. I cluster vengono sottoposi a imaging utilizzando la chimica di sequenziamento a due canali e una combinazione di filtri specifici per ciascun terminatore di catena marcato con coloranti fluorescenti. Il processo è ripetuto per ciascun ciclo di sequenziamento. Dopo l'analisi delle immagini, il software esegue l'identificazione delle basi, il filtraggio e il calcolo dei punteggi qualitativi. Sensibilità analitica e precisione. Durante la corsa di sequenziamento, il sistema MiniSeq garantisce dati di elevata qualità con oltre l'80% delle basi con uno score qualitativo di Q30* consentendo il sequenziamento in parallelo di milioni di frammenti di DNA e con sequenziamento più preciso di regioni ripetitive e omopolimeri. Chimica SBS a 2 canali Il metodo SBS a 2 canali richiede solo 2 immagini per ciclo, anziché 4. Questo accelera i tempi di elaborazione e sequenziamento dei dati, offrendo allo stesso tempo la stessa qualità e accuratezza che contraddistingue i sistemi Illumina. La tecnologia SBS a due canali presenta il vantaggio di ottenere tempi di sequenziamento ed elaborazione dei dati più rapidi. Nella chimica a 2 canali si utilizza un mix di coloranti. Le immagini sono acquisite da ciascun cluster di DNA usando bande di filtri a lunghezza d'onda rossa e verde. I cluster visti in immagini rosse o verdi sono interpretati come basi C e T, rispettivamente. I cluster osservati in entrambe le immagini rosse sono contrassegnati come basi A (che appaiono come cluster gialli), mentre i cluster non etichettati sono identificati come basi G.